棉花无菌苗培养条件的探讨

张福丽,葛红莲,纪瑞杰,黄云云

摘要：以棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）种子为试验材料，对无菌苗培养前种子消毒和接种的最佳条件进行了研究。结果表明，棉花种子消毒的最佳条件为１.0 ｇ／Ｌ升汞消毒５ ｍｉｎ或５０.0 ｇ／Ｌ次氯酸钠消毒１５ ｍｉｎ，无菌水冲洗５～６次，无菌水浸泡２４ ｈ，倒掉瓶中的无菌水后换上新的无菌水继续浸泡至种子露白约３～４ ｍｍ，手捏种子的子叶端挤掉种皮，胚根端接触培养基的方式接种至ＭＳ基本培养基。

关键词：棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）；无菌苗；培养

中图分类号：Ｓ５６２；Ｓ３５１．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）05－0887-03

Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ on Ａｓｅｐｔｉｃ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ

ＺＨＡＮＧ Ｆｕ－ｌｉ，ＧＥ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎ，ＪＩ Ｒｕｉ－ｊｉｅ，ＨＵＡＮＧ Ｙｕｎ－ｙｕｎ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｏｕｋｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｋｏｕ ４６６００0，Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｅｄ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ａｓｅｐｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ using ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄｓ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ sterilizing ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄ ｗｅｒｅ soaking for ５ ｍｉｎ in １ ｇ／Ｌ ＨｇＣｌ２ ｏｒ １５ ｍｉｎ in ５０ ｇ／Ｌ ＮａＣlＯ， washing for ５~６ ｔｉｍｅｓ ｗｉｔｈ ａｓｅｐｔｉｃ ｗａｔｅｒ， soaking ｉｎ ａｓｅｐｔｉｃ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ２４ ｈ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒeplacing ｎｅｗ ｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ ｔｏ ｓｏａｋ ｓｅｅｄ ｕｎｔｉｌ ｓｅｅｄ ｂｕｄｄｉｎｇ to ａｂｏｕｔ ３~４ ｍｍ， squeezing the ｓｅｅｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｅｎｄ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｃｏａｔ， ａｎｄ inoculating ｏｎ ＭＳ ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｔｔｏｎ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）； ａｓｅｐｔｉｃ； ｃｕｌｔｕｒｅ

棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）是我国重要的经济作物，通过转基因手段进行遗传改良是获得优良棉花品种的有效方法之一。在其转化研究中，如何获取健壮无菌苗作为外植体建立组织培养的高频再生体系，是有效开展此项工作的前提和基础。因此，在无菌苗培养时，种子消毒以及接种等环节就显得相当重要。对前者而言，不仅要求消毒彻底，还要使药剂对无菌苗的伤害最低。如果无菌苗受到的伤害较大就会长势不良，且直接影响后续的外植体的再分化及高频再生体系的建立。在植物的无菌苗培养中，不同的植物消毒方法会有所不同［１］。对西瓜种子而言，２５０ ｍｇ／Ｌ二氧化氯与１．５ ｇ／Ｌ的升汞联合使用，污染率最低［２］。为了建立一套高效、稳定且对无菌苗生长影响最低的无菌苗培养体系，研究了不同消毒方法对棉花无菌苗种子消毒效果及无菌苗生长的影响，探索出了高效、稳定的消毒方法，以期为改进棉花无菌苗的培育技术提供依据。

１材料与方法

１．１试验材料

棉花种子由本实验室保存，选子粒饱满、颜色正常和大小基本一致的健康棉花种子为试验材料，７５％（体积分数，下同）乙醇、１．０ ｇ／Ｌ升汞、１０％（体积分数，下同）双氧水、１．０ ｇ／Ｌ硝酸银和５０．０ ｇ／Ｌ次氯酸钠４种药品作为消毒剂。

１．２试验方法

１．２．１无菌苗的获得将棉花种子分成３份，一份用７５％乙醇表面预处理３ ｍｉｎ，另一份不用乙醇预处理，第三份则用乙醇表面预处理５ ｍｉｎ，然后分别用４种消毒剂进行消毒。４种消毒剂及消毒时间为：１０％双氧水消毒３ ｈ、１．０ ｇ／Ｌ升汞消毒５ ｍｉｎ、１．０ ｇ／Ｌ硝酸银消毒３０ ｍｉｎ和５０．０ ｇ／Ｌ次氯酸钠消毒１５ ｍｉｎ。每个处理共９０粒种子，其中３个重复中每个重复３０粒种子。处理后的种子用无菌水冲洗６～７次后接种在高压灭菌的ＭＳ固体培养基上，光照度为２ ０００ ｌｘ，２５ ℃温室中培养。

１．２．２数据处理当种子胚根长到４ ｍｍ左右时视为发芽，每２４ ｈ记录1次发芽情况，发芽结束后统计发芽起始时间、发芽率和污染率。然后对发芽率进行差异显著性分析。

发芽率＝（Ｎ１／３０）×１００％；污染率＝（Ｎ２／９０）×１００％；单株鲜重＝每个处理无菌苗的总重量／Ｎ１，其中：Ｎ１为每个重复发芽种子的总数；Ｎ２为３个重复污染种子的总数。

２结果与分析

２．１各种处理方法对污染率、发芽速度和无菌苗长势的影响

由表１可知，当用双氧水、升汞和次氯酸钠作为消毒剂时，是否用７５％乙醇处理对污染率的影响没有差异，平均污染率为０.0%，各组合间均无差异；当用硝酸银作为消毒剂时，乙醇预处理对污染率有影响，没有经过乙醇预处理的平均污染率为２２．２％。因此，从平均污染率来看，７５％乙醇分别和双氧水、升汞、硝酸银、次氯酸钠进行组合，以及双氧水、次氯酸钠和升汞单独使用较适合棉花种子的消毒，单独使用硝酸银不适合棉花种子的消毒。但在试验中发现，在无菌苗的长势方面，乙醇预处理对无菌苗的伤害很大，经７５％乙醇处理的无菌苗的长势比未经预处理的差，表现为生长不旺盛，且胚轴较细，易弯曲，叶片多卷曲，并且根部往往出现黄褐现象。经硝酸银消毒的无菌苗表现出平均株高矮、生长不旺盛，且始发芽时间较其他组合迟２～３ ｄ。

在发芽速度上，硝酸银作为消毒剂时，无论是否用７５％乙醇预处理，发芽均较其他药剂处理的迟２～３ ｄ，双氧水与７５％乙醇共同作用时发芽慢１ ｄ，其他组合间无明显差异，始发芽时间全部为２ ｄ（表１）。

２．２药剂与乙醇共同作用对发芽率的影响

方差分析结果（表２）表明，４种药剂对发芽率的均方是８８４．３０９，Ｆ＝４０．９４３，Ｐ=0.000＜０．０５，即存在显著性差异；乙醇预处理与否对发芽率的偏差均方是３９．８０２，Ｆ＝１．８４３，Ｐ＝０．１８０＞０．０５，即差异不显著；４种不同的药剂是否配用乙醇对发芽率的均方为１１．８４２，Ｆ＝０．５４８，Ｐ＝０．７６６＞０．０５，即差异不显著。

综合以上对平均污染率和发芽时间分析与试验观察发现，用双氧水、升汞和次氯酸钠消毒时，事前是否用乙醇处理没有显著差异。当用硝酸银消毒时，是否用乙醇预处理对污染率的影响有差异，用乙醇处理能显著减少污染率，但由于乙醇对无菌苗的伤害很大，直接降低外植体生长及进行分化的活力。因此，在进行棉花种子消毒时，不考虑使用乙醇，直接在４种药剂中寻求最佳消毒方法。

２．３４种药剂对发芽率的影响

４种药剂对棉花种子发芽率影响的多重比较如表３。结果表明：在对种子发芽率的影响上，硝酸银和升汞、双氧水及次氯酸钠之间差异显著，次氯酸钠和双氧水之间差异显著，次氯酸钠和升汞、双氧水和升汞之间差异不显著。其中，双氧水对发芽率的影响最小，其次是次氯酸钠和升汞，硝酸银的影响较大。同时由表１可知，硝酸银进行消毒易造成污染，因此，本试验中适合棉花种子消毒的药剂为双氧水、次氯酸钠和升汞。

２．４４种药剂对单株鲜重的影响

由图１可知，次氯酸钠对单株鲜重的影响最小，升汞次之，双氧水和硝酸银的影响较大。综合以上分析表明，在实际应用中可以使用次氯酸钠或升汞对棉花种子进行消毒。

３讨论

消毒剂种类的使用和接种方法在健壮无菌苗的获得中是很重要的。由于乙醇对无菌苗造成的伤害较大，因此，在对棉花种子消毒时最好不使用乙醇，用次氯酸钠、升汞和双氧水是比较有效的方法。但在试验中发现，虽然双氧水对棉花种子发芽率的影响最小，但经其消毒的种子发芽稍迟，且无菌苗长势较次氯酸钠和升汞的差，致使无菌苗的鲜重较低，并影响无菌苗外植体的分化能力。这可能是由于双氧水有轻微的腐蚀性，消毒后会加大种子中的物质向外渗漏，使种子的活力降低［3-５］。硝酸银作为消毒剂导致种子发芽慢，且对发芽率影响最大，因此不适合棉花种子消毒。虽然升汞对种子的毒性较双氧水大，但在清洗时，对用升汞消毒的种子多洗几次，其间并不断慢慢摇动，可有效清除残留的升汞。有研究表明，经１．０ ｇ／Ｌ升汞处理的种子发芽率和发芽势均不高［６］，消毒不彻底［７］。且消毒时间过长时，会对愈伤组织的生长产生抑制作用［８］。但在试验中发现，在用升汞进行消毒时，控制消毒时间和清洗环节可以有效克服这一缺陷，消毒５ ｍｉｎ后可以用无菌水清洗６～７次，每次坚持２ ｍｉｎ左右，其间并不时轻轻摇动，这样处理过的种子对发芽率和发芽势不会有影响。但是如果消毒时间过长，清洗６～７次仍然会对生长势有影响。有研究表明，单独使用次氯酸钠造成了２０％左右的番茄种子污染［９］。本研究发现，５０．０ ｇ／Ｌ次氯酸钠能有效控制棉花种子的污染，这与甘小洪等［１０］的研究结果一致，并没有对发芽率和长势造成明显影响。在对种皮的处理上，消毒前去掉种皮不如消毒后种子露白时去掉种皮为好，这样可以大大降低消毒剂对无菌苗造成的伤害，使无菌苗的长势更加旺盛；另外，种子露白时，不去掉种皮的无菌苗的长势不如去掉好，且易造成无菌苗高矮不齐。

在本试验中发现种子接种在培养基中的位置对种子发芽的影响也较大。如果把棉花种子的胚根端半埋在培养基中，有些虽然能发芽，但其发芽速度较其他慢３ ｄ左右，如果胚根端埋在培养基中再多一些，种子则不能发芽。可能是因为培养基的通透性较差，使种子的呼吸受到了影响。试验中观察到在接种种子时，要将种子平放，并使胚根端尽量靠近培养基，但不要埋在培养基中，这样种子发芽会更快。

参考文献：

［１］ 杜燕，蒋海玉，刘其宁．贮存过期油菜种子消毒方法的研究［Ｊ］． 种子，２００３（２）：３９－４０．

［２］ 李敏华，张洪溢． 无籽西瓜无菌苗萌发条件的研究［Ｊ］． 海南师范学院学报（自然科学版），２００１，１４（１）：８０－８３．

［３］ 傅家瑞． 种子的活力及其生理生化基础［Ｊ］．种子，１９８４（３）：１－５．

［４］ ＨＡＬＭＥＲ Ｐ，ＢＥＷＬＥＹ Ｊ Ｄ． Ａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｓｅｅｄ ｖｉｇｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ［Ｊ］． Ｓｅｅｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ，１９８４，１２（２）：５６１－５７５．

［５］ 钱秀诊，伍晓明，胡琼，等． 贮藏时间对油菜种子生理生化性状的影响［Ｊ］．中国油料作物学报，１９９３（３）：３０－３２．

［６］ 栾博宇，王洪君，于洪柱，等． 紫花苜蓿无菌苗培养前的种子消毒技术研究［Ｊ］．畜牧与饲料科学，２００９，３０（１０）：１７２－１７３．

［７］ 张志元，罗永兰，官春云． 油菜种子内生菌的检测及杀菌消毒处理方法［Ｊ］． 湖北农业科学，２００５（１）：５２－５５．

［８］ 任敬民，陈跃进，郭丽明． 台湾青枣组织培养的消毒方法［Ｊ］． 湖北农业科学，２００４（１）：６５－６８．

［９］ 吴志刚，宋明，王志敏，等．番茄组织培养中无菌苗培养条件的优化［Ｊ］． 中国农学通报，２００６，２２（４）：３３５－３３７．

［１０］ 甘小洪，刘馨．水青树组织培养中无菌苗培养条件的优化［Ｊ］． 亚热带植物科学，２００９，３８（４）：６６－６８．