便秘模型小鼠皮肤老化的观察

彭圆 程静 李伟 严进 田代志 郭岚 王平

[摘要]目的：观察便秘模型小鼠的皮肤老化,为肺与大肠相表里的归经药物研究提供动物模型。方法：以空白组和D-半乳糖致衰模型作对照，采用限水（1.5ml/天），叠加复方地芬诺酯(10mg/kg·d)灌胃6周建立便秘模型。通过小肠墨汁推进率、大肠和皮肤含水率判断便秘模型是否成功，同时进行血清、皮和肺超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、皮肤组织羟脯氨酸(Hydroproline，HYP)及透明质酸（Hyaluronic acid,HA）含量、皮肤的光镜检测。结果：与空白组比较，便秘组各项指标显示有显著性差异（P<0.01）。小肠推进率明显下降（P<0.01）；大肠和皮肤含水率下降（P<0.01）；皮肤明显变薄，胶原纤维数量减少；血清、皮肤及肺组织中SOD活力明显下降（P<0.01），皮肤组织中HYP含量减少（P<0.01）；皮肤组织匀浆中HA含量锐减（P<0.01）。与衰老模型组比较，无显著性差异。结论：便秘可导致皮肤衰老。抗氧化能力下降与皮肤组织HA含量减少可能是该便秘模型小鼠皮肤菲薄、干燥的病理机制。

[关键词]便秘；皮肤；衰老；小鼠模型

[中图分类号]R332R758 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）06-0947-03

衰老与便秘相关，已为历代医家所论述。如《论衡》中有“欲得长生，肠中常清；欲得不死，肠中无滓”。《扁鹊心书·便闭》：“老人气虚，及妇人产后血少，致津液不行，不得通流，故大便常结。”《医宗必读》云:“老年津液干枯…皆能便结”等。各种原因引起的便秘，其病位虽在大肠，由于五脏一体观之肺系统中大肠、皮毛与肺互为联络，如《素问·五脏生成》云：“肺之合皮也，其荣毛也”。《灵枢·本藏》曰: “肺合大肠, 大肠者, 皮其应”。《灵枢·本输》云：“肺合大肠。大肠者，传导之官”。故而大肠的病变常与肺的病变相关联，同时“肺与皮毛相合”，肺与皮肤的病变也常互为影响，所以大肠与皮肤在病理上也有紧密的联系。尽管近年来，对“肺与大肠相表里”的理论认识在不断加深，但从皮肤衰老角度进行其相关性研究并不多见。因此本研究以便秘模型动物为对象，观察其皮肤的老化现象，旨为肺与大肠相表里的归经药物研究提供动物模型。

1材料和方法

1.1 实验动物及材料

1.1.1 动物：2月龄昆明清洁级小鼠62只，（20±2）g，雌雄各半，购自华中科技大学同济医学院实验动物研究中心，标准饲料喂养。

1.1.2 药品：复方地芬诺酯(10mg/ kg·d)，江苏平光制药有限责任公司；D-半乳糖，张家港市华昌药业有限公司，用超纯水配成浓度为10%， 4℃冷藏备用。

1.1.3 主要器材：AL104型电子天平；DHG90A系列鼓风干燥箱；721型分光光度计； FSH-Ⅱ型可调高速电动匀浆机；TGL-16G-A型低温离心机(AnKe)；GC-1200r放免计数仪；RM2135 型旋转切片机；TB-718E型生物组织自动包埋机；Motic BA300数码光学显微镜。

1.1.4 主要试剂:超氧化物歧化酶（SOD）、羟脯氨酸（HYP）、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供。透明质酸放射免疫分析检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所。苏木素液、伊红染色液、乙醇、二甲苯、多聚甲醛购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 分组造模与处理: 将62只2月龄昆明清洁级小鼠，称重后按性别随机分为空白组、便秘组、衰老组。用苦味酸标记。其中便秘组22只，其余组各20只。空白组常规摄食、饮水及光照。衰老组参照文献[1]按1000mg/kg·d于颈背部皮下注射D-半乳糖，制备亚急性衰老动物模型。便秘组参照文献[2-3]略做改进，采用限水（正常小鼠日需水量的1/3即1.5ml），叠加复方地芬诺酯(10mg/kg·d)灌胃建立复合便秘模型，灌胃顺序依次为超纯水（20ml/kg·d）、复方地芬诺酯（10ml/ kg·d）、超纯水（补充余量），间隔3h；空白组以超纯水做对照；共6周。实验过程中便秘组有2只死亡。

实验结束后于第43天每组一半做墨汁推进实验，另一半做其余实验。行眼眶取血，常规离心制备血清；行两肩胛至两髂骨之间的备皮，在冰上取备皮后的背部皮肤组织块和开胸后肺组织, 制备10%组织匀浆，-20℃冰箱贮存备用；剪取上自回盲部、下至直肠的肠管，去除内容物后用万分之一电子天平精确称其湿重；在冰上取背部2cm×2cm大小皮肤，用万分之一电子天平精确称其湿重；取背部正中0.5cm×0.5cm大小皮肤，迅速放入4％多聚甲醛中固定进行形态学观察。

1.3 标本制备及检测

1.3.1 小肠墨汁推进功能检测(墨汁推进实验)：在实验结束后禁食20h。将墨汁与各组灌胃的液体物质按1：2体积比配制。参照文献[4]，计算墨汁推进率(%)=〔墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)〕×100%。

1.3.2 大肠及皮肤含水率实验：称湿重后的肠管放到80℃干燥箱中烘3h至恒重，称取干重；将称湿重后的皮肤放到80℃干燥箱中烘12h，称取干重，计算组织含水率。组织含水率(%)=（组织湿重-组织干重）／组织湿重×100%。

1.3.3血清、皮肤及肺组织SOD活性检测：采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性测定。考马斯亮兰蛋白测定试剂盒并检测皮肤蛋白含量。

1.3.4 皮肤HYP含量及透明质酸含量的测定：采用样本碱水解法检测HYP含量。由湖北中医附院核医学科采用放免法测定HA含量。

1.3.5皮肤组织学观察：固定24h后常规脱水、透明、浸蜡、包埋，石蜡切片、脱蜡、脱水、HE染色，光镜下观察，显微摄影（摄像头：MOTICAM 3000）。

1.4 统计学处理：采用SPSS15.0 for Windows 软件包进行数据分析。数据用 表示，组间比较用方差分析并用最小显著差法(LSD)做两两比较。当各组方差不齐时用Dunnetts''''C法做两两比较。

2结果

2.1 便秘模型小鼠肠道传输功能及含水实验、皮肤含水功能检测：见表1，可以看出,与空白组比较，便秘组小肠墨汁推进率、大肠含水率、皮肤组织含水率及皮肤HA均显著降低（P<0.01）。便秘组与衰老组比较，无显著性差异。

2.2 便秘模型小鼠抗氧化能力检测：见表2，可以看出,与空白组比较，便秘组血清中SOD活性显著降低（P<0.01）；皮肤SOD活性、羟脯氨酸含量均显著降低（P<0.01）；肺SOD活性均显著降低（P<0.01）。便秘组与衰老组比较，无显著性差异。

2.3 皮肤组织HE染色结果：空白组小鼠皮肤结构完整。表皮与真皮界线清晰，表皮薄，较规则；真皮层厚，胶原纤维丰富交错排列，大量成纤维细胞可见；皮下未见脂肪细胞填充。与空白组比较，衰老组小鼠皮肤变薄，结构完整。表皮薄，真皮胶原纤维数量减少，成纤维细胞数量减少，皮下脂肪层细胞填充明显增多，厚达6～9层。与空白组比较，便秘组小鼠皮肤变薄，结构完整。表皮薄，真皮胶原纤维数量减少，成纤维细胞数量减少，皮下脂肪细胞填充较少，仅1～2层。

3讨论

3.1 由于机体本身的代偿机制存在，当短期限水或禁水时，容易自然恢复，故本课题在借鉴前人研究成果的基础上,对复方地芬诺酯模型和短期限水模型加以改进，建立连续6周限水（仅维持小鼠正常日需水量的1/3）加大剂量复方地芬诺酯（10mg/ kg·d）并用的复合便秘模型。结果显示该模型小鼠已出现明显的小肠墨汁推进率与大肠含水的降低，可见复合因素造模后，模型动物出现了肠道传输功能明显下降，大肠含水量显著降低。不仅如此，皮肤含水量也明显减少。这与临床肠燥津亏证的一般特点如皮肤干燥、大便干结难解等类似。对皮肤含水功能进一步的研究发现模型鼠皮肤中HA含量明显减少，可能是导致皮肤组织含水减少，出现皮肤干燥变薄表象的原因之一。

3.2 现代医学研究表明，便秘不仅使消化道处于创伤应激中心地位，还可加剧体内的氧自由基反应和脂质过氧化反应，削弱机体对抗自由基的能力[5]，这与本实验抗氧化能力结果一致。其中血清与肺SOD活性检测的结果提示，模型鼠对抗氧自由基的能力锐减，使暴露于有氧环境中肺成为氧化应激发生的一个重要位点，从而参与机体衰老的发展进程。

3.3 大量流行病学、临床和实验研究支持氧化应激损伤是皮肤衰老主要机制之一[6-8]。本研究抗氧化能力的结果还显示，模型鼠皮肤SOD 活性明显下降，皮肤HYP含量显著降低，且与镜下皮肤变薄真皮胶原纤维数量减少的形态学变化结果保持一致，表明便秘模型动物体内呈现出明显的氧化应激反应。其抗氧化防御能力的下降，是导致皮肤细胞损伤加剧、皮肤老化的一大机制。

3.4 中医认为人体是一个有机整体。“藏之于内必象之于外”，通过观测皮肤改变，可以洞察体内脏腑的功能状态。本实验通过皮肤组织形态学观察及定量分析和皮肤抗衰老指标的检测，结果证明，该模型小鼠皮肤中各项指标变化与D-半乳糖致亚急性衰老模型皮肤的改变相一致,无显著性差别，从而说明便秘可以导致衰老，可成为皮肤衰老的一大诱因。

综上所述，本实验通过复方地芬诺酯灌胃叠加饮水限制，造成了与临床相符的肠燥津亏证便秘动物模型。抗氧化能力下降与皮肤组织HA含量减少可能是该便秘模型小鼠皮肤菲薄、干燥的病理机制。基于大肠、皮毛与肺互为联络关系，本模型从皮肤衰老角度初步为“肺与大肠相表里”研究提供了新思路，值得深入“肺与大肠相表里”的归经药物研究。

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[收稿日期]2012-02-21[修回日期]2012-04-07

编辑/张惠娟