2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的制备及其抗菌性分析

龚安华 吴涛 吴静 钱琛

摘要：以２，３－环氧丙基三甲基氯化铵（ＧＴＡ）和壳聚糖为原料制备水溶性的壳聚糖季铵盐２－羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（ＨＴＣＣ），采用傅立叶红外光谱仪（ＦＴＩＲ谱图）和核磁共振仪（１Ｈ－ＮＭＲ图谱）表征ＨＴＣＣ的结构，并进行抗菌性研究。结果表明，ＨＴＣＣ溶液和浸泡过ＨＴＣＣ的无纺布对大肠杆菌（Escherichia coli）和空肠弯曲菌（Cａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）有抑菌效果，其中对空肠弯曲菌的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）为８ ｍｇ／ｍＬ，说明ＨＴＣＣ是一种具有应用潜力的高分子抗菌剂。

关键词：壳聚糖季铵盐；表征；抗菌性；HTCC

中图分类号：Ｏ６３６．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）06－1136-03

Characterization and Antimicrobial Activity of 2-Hydroxypropyltrimethyl Ammonium Chloride Chitosan

ＧONG Ａｎ－ｈｕａ，ＷU Ｔａｏ，ＷU Ｊｉｎｇ，ＱIAN Ｃｈｅｎ

(Department of Chemical Engineering, Yangzhou Polytechnic Institute, Yangzhou 225127, Jiangsu, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ ｏｆ 2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride ｃｈｉｔｏｓａｎ（ＨＴＣＣ） ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｗｉｔｈ ２， ３－ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（GTA）． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＴＣＣ ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ＦＴＩＲ ａｎｄ １Ｈ ＮＭＲ， ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＨＴＣＣ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅd ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｗｏｖｅｎ ｆａｂｒｉｃｓ ｗｈｉｃｈ ｈａd ｂｅｅｎ ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｉｎ ＨＴＣＣ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅd ｇｏｏｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ． Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ） ｏｆ ＨＴＣＣ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ ｗａｓ ８ ｍｇ／ｍＬ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＨＴＣＣ waｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ； ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ； 2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan（ＨＴＣＣ）

殼聚糖（ＣＴＳ）是甲壳素经浓碱溶液处理后脱去乙酰基的产物，又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素，化学名 （１，４）－２－氨基－２－脱氧－β－Ｄ－葡萄糖。壳聚糖以其独特的生物相容性、生物降解性、抗菌性、无毒性、生物活性和其独特的物理化学属性引起人们的重视，在化工、纺织、印染、造纸和医药等领域有广泛的应用前景［１］。但是由于壳聚糖分子内、分子间存在强大的氢键作用，大分子间存在着紧密的晶态有序结构，难以熔化，也难以溶解于水和多数有机溶剂，限制了其实际应用。而经过衍生化的壳聚糖克服了其溶解性差的缺点，能很好溶解，并增加了正电性。

虽然目前已有文献报道了壳聚糖的酰基化、羧基化、烷基化、酯化、形成席夫碱和交联等改性研究［２－５］，但对这些衍生物的应用研究的报道却较少。２－羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（ＨＴＣＣ）是一种合成工艺较为成熟的水溶性壳聚糖衍生物，本试验利用环氧开环法［２］铵盐制备ＨＴＣＣ，并进一步研究ＨＴＣＣ的抗菌性。

１ 材料与方法

１．１材料

１．１．１试验试剂壳聚糖（脱乙酰度９０％，连云港生物制剂有限责任公司）；冰醋酸、氢氧化钠、异丙醇、硫酸钠、无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；２，３－环氧丙基三甲基氯化铵（ＧＴＡ）（工业级，杭州银湖化工有限公司）；大肠杆菌、空肠弯曲菌（革兰氏阴性菌）；无纺布（市售）；其他培养液（自制）。

１．１．２仪器与设备Ｔｅｎｓｏｒ ２７型傅立叶红外光谱仪（德国Ｂｒｕｋｅｒ公司）；ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ生物分光光度计（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；ＡＣＦ３００核磁共振光谱仪（德国Ｂｒｕｋｅｒ公司）。

１．２方法

１．２．１ＨＴＣＣ的合成［２］称取２ ｇ壳聚糖溶于１００ ｍＬ ２％的乙酸溶液，搅拌溶解后逐滴加入１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶液至ｐＨ为９，有大量白色絮状壳聚糖析出，再浸泡８ ｈ，然后抽滤得到白色沉淀物用去离子水洗至中性。将白色沉淀物及１５ ｍＬ异丙醇加入到三颈瓶中，搅拌并升温至８０ ℃，定时（每隔２ ｈ）滴入定量的ＧＴＡ异丙醇溶液（０．５ ｍｇ／ｍＬ），每次滴定时间为０．５ ｈ。反应结束后，加入１５０ ｍＬ的无水乙醇进行沉淀，抽滤后用无水乙醇洗涤３次，６５ ℃真空干燥２４ ｈ。

１．２．２ＨＴＣＣ的抗菌试验菌悬浮液的制备：将活化后的细菌用接种环挑取2环菌苔于无菌ＰＢＳ缓冲溶液中，使用ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ生物分光光度计调节ＯＤ值为１，备用。

抗菌效率的测定：取１ ｍＬ ＯＤ值为１的菌悬浮液加入到５ ｍｇ／ｍＬ的１００ ｍＬ壳聚糖季铵盐溶液中，同时取１ ｍＬ菌液加入到１００ ｍＬ的ＰＢＳ缓冲液中作为对照，分别在混合后１５、３０、６０ ｍｉｎ涂平板，３７ ℃培养箱培养２４ ｈ，观察试验结果。用平板计数法计数并计算抑菌率。

抑菌率＝■×１００％。

最低抑菌浓度（ＭＩＣ）的测定：用ＰＢＳ缓冲溶液配制不同浓度的ＨＴＣＣ溶液（０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ ｍｇ／ｍＬ），高压灭菌。取１１个平板，分别取上述不同浓度ＨＴＣＣ溶液３００ μＬ涂覆平板，再取１００ μＬ的ＯＤ值为１的菌悬浮液均匀涂抹平板，置３７ ℃培养箱培养４８ ｈ后，观察菌落的生长情况，以完全无菌落的ＨＴＣＣ溶液最低浓度为ＨＴＣＣ的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）。

ＨＴＣＣ溶液浸渍无纺布的抑菌性：配制１０ ｍｇ／ｍＬ的ＨＴＣＣ溶液２５０ ｍＬ，高压灭菌备用。取边长２ ｃｍ的正方形无纺布２块，分别编号ａ、ｂ。其中ａ样放置在蒸馏水中浸泡２４ ｈ作为对照，ｂ样放置在相同体积ＨＴＣＣ溶液中浸泡相同时间。取出无纺布并分别贴于平板中央，３７ ℃培养箱中培养２４ ｈ，观察菌落的情况。

１．２．３红外光谱测定分析红外光谱测定样品的结构，使用德国Ｂｒｕｋｅｒ公司的Ｔｅｎｓｏｒ２７型傅立叶红外光谱仪，ＫＢｒ压片，扫描范围４ ０００~４００ ｃｍ－１，分析ＦＴＩＲ谱图。

１．２．４１Ｈ核磁分析采用ＡＣＦ３００核磁共振光谱仪（５００ ＭＨｚ），Ｄ２Ｏ为溶剂，四甲基硅烷为内标，绘制分析１Ｈ－ＮＭＲ谱图。

２结果与分析

２．１ＨＴＣＣ的抑菌特性

２．１．１ＨＴＣＣ抑菌效率由ＨＴＣＣ作用时间对抑菌率的影响（图１）可见，作用时间越长，ＨＴＣＣ溶液抑菌效果越好，与大肠杆菌和空肠弯曲菌作用１５ ｍｉｎ后，抑菌率分别达到９７．７３％和９８．４０％。ＨＴＣＣ对空肠弯曲菌的抑菌率明显高于对大肠杆菌的抑菌率，推测原因为空肠弯曲菌表面负电性高于大肠杆菌，增强了ＨＴＣＣ对空肠弯曲菌的吸附力。

２．１．２ＨＴＣＣ对空肠弯曲菌的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）ＨＴＣＣ最小抑菌浓度测定结果（表１）显示，随着ＨＴＣＣ溶液浓度的增大，对空肠弯曲菌的抑菌效果明显提高。ＨＴＣＣ溶液浓度≥１ ｍｇ／ｍＬ，对空肠弯曲菌有抑菌效果，浓度为８ ｍｇ／ｍＬ时可以完全抑制其生长，ＨＴＣＣ溶液对空肠弯曲菌的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）为８ ｍｇ／ｍＬ。

２．１．３经ＨＴＣＣ浸渍的无纺布的抑菌作用蒸馏水和ＨＴＣＣ溶液浸渍无纺布后，从无纺布的抑菌试验结果（图２）可见，浸渍过ＨＴＣＣ溶液的无纺布的平板内没有细菌生长（图２ｂ），具有抑菌效果；而浸渍过蒸馏水的无纺布的平板内则有细菌生长（图２ａ）。可见ＨＴＣＣ具有良好的抑菌性，可作为一种具有应用潜力的抗菌剂。

２．２ＨＴＣＣ的ＦＴＩＲ表征

由壳聚糖和２－羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的ＦＴＩＲ谱图（图３）可见，ＣＴＳ和ＨＴＣＣ都在 ３ ４０９ ｃｍ－１（－ＯＨ伸缩振动峰）、１ ０６５ ｃｍ－１（Ｃ－Ｏ伸缩振动峰）、１ １６３ ｃｍ－１（Ｃ－Ｎ伸缩振动峰）出现了多糖骨架的特征吸收峰。在ＨＴＣＣ的红外谱图中，壳聚糖在１ ５７７ ｃｍ－１处伯氨基的Ｎ－Ｈ面内弯曲振动吸收峰消失，而在１ ４８６ ｃｍ－１、１ ６４８ ｃｍ－１、３ ０27 ｃｍ－１处出现了新的吸收峰，分别为季铵盐化基团中－ＣＨ３的变形振动峰和伸缩振动峰，表明壳聚糖分子中－ＮＨ２中的Ｈ已经被－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｃｌ－基團部分取代并生成了２－羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖［６－８］。

２．3１ＨＮＭＲ表征

从ＨＴＣＣ的１Ｈ－ＮＭＲ谱图（图４）可见，在３．２０３ １处出现了引进的季铵盐支链基团中３个甲基（Ｃ４）上的Ｈ的峰，４．５１１ ３对应于吡喃苷杂环Ｃ１上的Ｈ，而在２．７６７ ２、４．３０１ ４、３．３９２ ５处出现的峰分别对应于所引进的季铵盐支链基团上的Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３上的Ｈ，２．５３１１、３．６０７３、３．６９５９、３．７５７３分别对应于杂环中的Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６上的Ｈ，这些数据与文献［６－８］中用ＧＴＭＡＣ改性剂对壳聚糖进行接枝改性得到的壳聚糖季铵化衍生物的１Ｈ－ＮＭＲ谱图中的数据相近。可见2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖为壳聚糖Ｃ２位氨基上发生取代反应的产物。

３结论

利用环氧活性基团与壳聚糖分子中的氨基反应，生成ＣＴＳ衍生物ＨＴＣＣ，试验验证了ＨＴＣＣ的抑菌效果。结果表明，ＨＴＣＣ对空肠弯曲菌和大肠杆菌具有抑菌作用，其抑菌率随作用时间的延长而提高；ＨＴＣＣ对空肠弯曲菌的抑菌效果较好，其最小抑菌浓度为８ ｍｇ／ｍＬ，说明ＨＴＣＣ可作为一种具有应用潜力的抗菌剂。

参考文献：

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