胆碱能抗炎通路对内毒素复合油酸致大鼠急性肺损伤的影响

郑 晖 许绍发 贾鸿彦 古淑香

1.首都医科大学附属北京胸科医院麻醉科，北京 101149;2.首都医科大学附属北京胸科医院胸外科，北京 101149;3.首都医科大学附属北京胸科医院结核病分子生物学实验室，北京 101149)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)由于发病机制尚不完全明确，同时缺乏有效的治疗手段，发病率和病死率仍居高不下。研究［1］显示其发病基础与Toll－样受体(Toll-like receptors，TLRs)介导的炎性反应有关。胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)是新近学者发现的一条神经－免疫调节通路［2］，它通过迷走神经及其递质乙酰胆碱与免疫系统相互作用，参与抗炎作用。动物实验研究结果［3］已经证实，CAP可以抑制脂多糖诱导的肿瘤坏死因子的产生和释放，但其确切的作用靶点是否与TLRs有关目前未见报道。本研究拟采用电刺激迷走神经和静脉注射胆碱酯酶抑制剂他克林的方法激活CAP，观察其对内毒素复合油酸2次打击致大鼠急性肺损伤的影响，并验证其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

PCR扩增仪 (美国Bio-Rad公司)，凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)，全自动血气分析仪(瑞士AVL公司)，450 nm酶标仪(美国Bio-Rad公司)，动物呼吸机(HX-200，成都泰盟科技有限公司)，脂多糖(美国SIGMA公司)，油酸(分析纯)(北京金龙科技有限公司)，大鼠IL-6 ELISA试剂盒(美国 MARKET公司)，羊抗 NF-κBp65单抗(武汉博士德生物工程公司)，大鼠IgG免疫印迹增强化学发光法试剂盒(武汉博士德生物工程公司)，髓过氧化物酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，PCR引物(北京赛百盛生物公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与处理

24只清洁级雄性Wistar大鼠(北京市结核病胸部肿瘤研究所动物实验室提供，SCXK:京2005－0004)，体质量250±20g。实验前于本所动物实验室饲养2周，常规饲料及饮水，昼夜交替12 h，饲养环境为清洁级。制模型前禁食不禁水12 h。2%戊巴比妥40 mg·kg－1腹腔注射麻醉后，沿正中线切开颈部皮肤，切开气管，置入14G套管，与小动物呼吸机连接行机械通气，潮气量:3～5 mL，呼吸频率:40～50次/min，吸入氧浓度:21%。分离右侧股静脉，置入22G套管针以作注射药物之用，稳定10 min后开始分组操作并监测。按数字表法将动物随机分4组，每组6只。①对照组(control group，C组):腹腔注射0.9%氯化钠注射液10 mL·kg－1;②急性肺损伤组(ALI组):腹腔注射1%内毒素(lipopolysaccharide，LPS)10 mg·kg－1，30 min后经股静脉缓慢注射油酸(oleic acid，OA)0.15 mL·kg－1;③电刺激组(stimulation group，ST组):右颈迷走神经干连接刺激电极，以5 V、2 ms、1 Hz 强度持续刺激神经 10 min，腹腔注射1%LPS 10 mg·kg－1，再持续刺激神经10 min，20 min后经股静脉缓慢注射OA 0.15 mL·kg－1;④他克林(tetrahydroaminoacridine，THA)组:静脉注射THA 1.5 mg·kg－1，10 min 后行 ALI组操作。130 min 时活杀大鼠后取左肺组织，无菌冰0.9%氯化钠注射液中洗净肺内血液，立即分装保存于液氮中。从颈总动脉采血2 mL置于无菌无致热原Eppendorf管中，离心(4 000 r/min，4℃)15 min后，取上清保存于－70℃。

1.2.2 血中pH和气压的检测

实验结束时抽取动脉血检测pH值、血氧分压(partial pressure of oxygen，PaO2)和二氧化碳分压(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)。

1.2.3 病理学检查

处死大鼠，剖胸肉眼观察肺脏形态学改变，取右肺下叶组织，经固定、包埋、切片、HE染色后，光镜下观察，根据肺间质水肿、肺泡水肿、炎细胞浸润、肺泡出血、透明膜形成、肺不张改变，按程度“无、轻、中、重”分别计“0、1、2、3 分”，然后累计总分［4］。

1.2.4 肺组织含水量测定

取右肺上叶组织用冷0.9%氯化钠注射液冲去残血，滤纸吸干水分在分析天平上精确称量湿质量(wet weight，W)，于80℃烘干 72h，再称量干质量(dry weight，D)，以湿质量/干质量比值(W/D)表示肺组织含水量。

1.2.5 肺组织髓过氧化物酶(mycloperoxidase，MPO)测定

取部分左肺组织制备10%组织匀浆，不离心，用蛋白定量(双缩脲法)测试盒测定组织匀浆蛋白浓度，用比色法测定肺组织MPO含量，以每克组织湿片中MPO活力单位表示。

1.2.6 左肺核转录因子－κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65含量检测

采用免疫印迹方法检测左肺组织中NF-κBp65含量。具体步骤:肺组织30 mg，加入裂解液中匀浆，离心(12 000 r/min，4℃)30 min，取上清，Bradford 法测定总蛋白浓度。样本各取40 μg上样，行10%SDSPAGE电泳分离蛋白，转移至硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，羊抗NF-κBp65单抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG 37℃孵育1 h，ECL显像成影。扫描后用HPIAS-1000凝胶分析系统定量，计算光密度值(A)。

1.2.7 血清白细胞介素－6(interleukin-6，IL-6)含量测定

处死大鼠时从颈总动脉采血2 mL置于无菌无致热源Eppendorf管中，离心(4 000 r/min 4℃)15 min后，取上清保存于－70℃。采用固相三明治夹心、酶联免疫吸附试验检测血浆IL-6含量。

1.2.8 左肺组织TLR2和TLR4mRNA表达

采用逆转录－聚合酶链反应方法。具体步骤:取肺组织约100 mg抽提与纯化总RNA。实验所用引物应用吕镗烽等［5］设计的引物，委托赛百盛公司合成。tlr2引物序列:上游引物:5'-AGT GAG TGG TGC AAG TAT GA-3';下游引物:5'-TAA GGC AAG ACA GAA ACA GG-3'。tlr4引物序列:上游引物:5'-CTG CAA TCA AGA GTG CTG AG-3';下游引物:5'-TTC TTG GCT TGA CCA GTC TC-3'。β-actin引物序列:上游引物:5'-ACT GCC GCA TCC TCT TCC TC-3';下游引物:5'-AAG CAT TTG CGG TGC ACG A-3'。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后应用凝胶成像仪拍照，凝胶分析软件对电泳条带进行分析，根据Marker确认目标基因扩增片段的条带，以目的基因与内参对照的积分吸光度比值(tlr/β-actin ratio)表示 mRNA相对表达量。

1.3 统计学分析

用SPSS13.0统计软件分析数据。计量数据以均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，均数多重比较采用Newman-Keuls法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血气指标及病理学改变

ALI组与C组比较，pH，PaO2和PaCO2差异有统计学意义(P＜0.01);ST组和THA组与ALI组比较，pH，PaO2和PaCO2差异有统计学意义(P＜0.01)，详见表1。肉眼观察，C组左肺呈鲜红色;ALI组呈暗紫色，弹性差，支气管内可见粉红色液体;ST组和THA组颜色稍暗。光镜下ALI组肺泡破坏严重，大量组织液渗出;ST组和THA组大鼠肺组织充血，肺泡扩张(图1)。病理学评分详见表1。

2.2 肺W/D及MPO改变

ALI组与C组比较肺组织W/D及MPO活性差异有统计学意义(P＜0.01);ST组和THA组与ALI组比较2种测量值差异有统计学意义(表2)。

表1 4组动物动脉血气及病理学评分结果Tab.1 Comparison of blood gas parameters and pathological score among the 4 groups of animal(n=6，)

表1 4组动物动脉血气及病理学评分结果Tab.1 Comparison of blood gas parameters and pathological score among the 4 groups of animal(n=6，)

△1 mmHg=0.133 kPa;*P＜0.05 vs C group;＊＊P＜0.01 vs C group;▲▲P＜0.01 vs ALI group;C:control;ALI:acute lung injury;ST:stimulation;THA:tetrahydroaminoacridine;PaO2:partial pressure of oxygen;PaCO2:partial pressure of carbon dioxide.

图1 4组大鼠肺组织病理改变Fig.1 Pathological changes of lung tissue of the 4 groups of rats(HE，100×)

表2 肺组织W/D值和MPO活性比较Tab.2 Comparison of lung tissue W/D value and MPO activities(n=6，)

表2 肺组织W/D值和MPO活性比较Tab.2 Comparison of lung tissue W/D value and MPO activities(n=6，)

＊＊P＜0.01 vs C group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs ALI group;C:control;ALI:acute lung injury;ST:stimulation;THA:tetrahydroaminoacridine;W/D:wet weight/dry weight;MPO:mycloperoxidase.

Group W/D MPO activity/(U·g－1)C group 4.52±0.64 0.36±0.08 ALI group 8.44±0.67＊＊ 1.20±0.14＊＊ST group 5.68±0.82▲ 0.42±0.06▲▲__THA group 5.02±0.66▲ 0.55±0.08▲▲______

2.3 肺组织 TLR2、TLR4 mRNA 表达、NF-κB p65及血清IL-6浓度改变

4组大鼠肺组织tlr2、tlr4和β-actin基因表达产物通过RT-PCR方法所得的特异性DNA片段长度分别为256 bp、355 bp和440 bp，与预期长度相符(图2A)。与C组比较，其余3个实验组肺组织TLR2和TLR4mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.01);其他组组间比较差异无统计学意义(P﹥0.05)(图2B，2C)。ALI组与C组比较肺组织NF-κB p65蛋白表达明显增强，IL-6浓度显著升高差异有统计学意义(P＜0.01);ST组、THA组与ALI组比较，NF-κB p65表达均减弱;血清IL-6浓度差异有统计学意义，详见图3，图4。

3 讨论

图2 4组大鼠肺组织TLR2、TLR4 mRNA表达结果Fig.2 Results of TLR2，TLR4 mRNA RT-PCR of the 4 groups of rats(n=6，)

图3 4组大鼠肺组织NF-κB p65蛋白水平Fig.3 Comparison of expression of NF-κB p65 protein in lung tissues of the 4 groups(n=6，)

图4 4组大鼠血清IL-6浓度Fig.4 Serum level of IL-6 in rats of the 4 groups(n=6，)

大多数肺损伤病人是在受到一次打击 (如烧伤、失血等)后，当全身性炎性反应已经消退的时候如果出现感染或缺血再灌注损伤等“2次打击”，机体发生的抗炎性反应抑制了免疫反应，病人对感染失去抵抗，其后果远较单次打击更为严重。最近关于ALI的基础研究成功地建立了不同“2次打击”动物模型［6］。美国国家心肺血液研究小组［7］认为这一研究方法有助于从更加贴近临床的角度揭示急性呼吸窘迫综合征的发病机制。本研究结果证明，内毒素复合油酸激活大鼠肺脏TLR2和TLR4，通过一系列细胞内级联反应，产生大量致炎细胞因子，形成全身性炎性反应，导致严重的肺部病理性改变，从而造成比单一打击本身更大的损伤。

机体通过免疫系统对炎性反应强度进行精细的调节。本世纪初，Borovibova L A等［8］发现副交感神经主要递质乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)能有效地抑制LPS刺激外周巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor－α，TNF-α)，刺激迷走神经传出支可抑制大鼠内毒素血症时的全身炎性反应，因此认为迷走神经及其递质有抗炎作用［9］。有研究［10］显示Ach可抑制巨噬细胞中TNF蛋白表达，但对TNF mRNA的转录无影响，表明CAP是在转录后水平影响细胞内信号转导过程从而抑制细胞因子合成的。另有研究［11］证实，烟碱可以抑制内毒素引起的NF-κB途径的活化，但是对于CAP在细胞内通过何种途径发挥作用至今没有明确。

本研究RT-PCR结果证实了电刺激迷走神经和静脉注射THA没有引起ALI大鼠肺组织TLR2和TLR4mRNA显著改变，但是可以显著降低肺组织NF-κBp65和血清IL-6蛋白含量。电刺激迷走神经致使外周神经末梢大量释放Ach;THA是一种特异性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，它可以抑制胆碱酯酶的降解作用，阻止已释放的Ach的清除，引起Ach较高浓度的聚集，发挥更强的免疫调节作用。有实验［12］证明，静脉注射THA可以减少失血性休克大鼠血浆TNFα和肝组织NF-κB的表达。本实验证明通过以上两种方法增加的Ach对致炎物质激活TLRs的作用没有直接影响，但是可以阻断其下游的NF-κB活化，使NF-κB不能进入细胞核内进行转录，从而减少了炎症因子的合成和释放。有研究者［13］检测了烟碱对内皮细胞NF-κB和NF-κB抑制蛋白家族成员活性的影响，结果显示，烟碱减少人微血管内皮细胞在TNFα作用后NF-κB的核转移。因此本研究组认为，CAP是在转录前发挥作用的。

本实验中电刺激迷走神经与静脉注射THA的作用相似，都增加了具有抗炎作用的递质Ach的浓度，发挥了CAP更强的免疫调节作用。CAP通过抑制ALI大鼠肺组织NF-κB的活化，减少了IL-6等促炎因子的释放，使肺组织MPO活性降低，说明中性粒细胞在肺内的扣押减少;ST组和THA组肺组织病理改变较ALI组明显减轻，W/D值的降低反映了肺组织炎症渗出减少;血气分析结果的改善说明缺血缺氧得到缓解。以上实验观察均说明电刺激迷走神经或静脉注射THA通过兴奋CAP可以有效抑制LPS复合油酸造成的肺损伤。

综上所述，本研究得出如下结论:电刺激迷走神经或者静脉注射他克林可通过激活CAP，减轻LPS复合油酸2次打击致大鼠ALI时的炎性反应;其可能机制是抑制NF-κB途径活化，在转录前水平发挥抗炎作用，但是不影响ALI时TLR2和TLR4mRNA的活化。

［1］Kovach M A，Standiford T J.Toll like receptors in diseases of the lung［J］.Int Immunopharmacol，2011，11(10):1399-1406.

［2］Johnston G R，Webster N R.Cytokines and the immunomodulatory function of the vagus nerve［J］.Br J Anaesth，2009，102(4):453-462.

［3］Giebelen I A，van Westerloo D J，LaRosa G J，et al.Stimulation of alpha 7 cholinergic receptors inhibits lipopolysaccharide-induced neutrophil recruitment by a tumor necrosis factor alpha-independent mechanism［J］.Shock，2007，27(4):443-447.

［4］Sun D，Zhao M，Ma D，et al.Protective effect of interleukin－1 receptor antagonist on oleic acid-induced lung injury［J］.Chin Med J(Engl)，1996，109(7):522-526.

［5］吕镗烽，宋勇，施毅，等.失血性休克鼠肺组织Toll样受体基因的表达［J］.中国危重病急救医学，2005，17(9):519-522.

［6］Lang J D，Hickman-Davis J M.One-hit，two-hit...is there really any benefit?［J］.Clin Exp Immunol，2005，141(2):211-214.

［7］Matthay M A ，Iimmerman G A，Esmon C，et al.Future Research Directions in Acute Lung Injury:Summary of a National Heart，Lung，and Blood Institute Working Group［J］.Am J Respir Crit Care Med，2003，167(7):1027-1035.

［8］Borovikova L A，Iavnova S，Zhang M，et al.Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin［J］.Nature，2000，405(6785):458-462.

［9］Bernik T R，Friedman S G，Ochani M，et al.Pharmacological stimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway［J］.J Exp Med，2002，195(6):781-788.

［10］Wang H，Yu M，Ochani M，et al.Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation［J］.Nature，2003，421(6921):384-388.

［11］Mabley J，Gordon S，Pacher P.Nicotine exerts an anti-inflammatory effect in a murine model of acute lung injury［J］.Inflammation，2011，34(4):231-237.

［12］李建国，胡正芳，杜朝晖，等.胆碱能抗炎通路对失血性休克大鼠保护作用的研究［J］.中国危重病急救医学，2005，17(1):24-26.

［13］Saeed R W，Varma S，Peng T，et al.Cholinergic stimulation blocks endothelial cell activation and leukocyte recruitment during inflammation［J］.J Exp Med，2005，201(7):1113-1123.