低氧诱导VEGF基因表达载体治疗家兔肢体缺血性疾病的实验研究

殷爱红 武文琦 崔世军 滕 旭 郑少鹏*

(1.首都医科大学医学实验与测试中心，北京 100069;2.首都医科大学宣武医院胸心血管外科，北京 100053;3.首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，北京 100069)

下肢缺血性疾病(ischemic lower limb)常见于下肢动脉硬化闭塞症、糖尿病动脉硬化闭塞症、下肢血栓闭塞性脉管炎等疾病，是一种严重危害人体健康、降低患者生活质量的疾病，具有较高的病死率。传统的治疗手段包括药物治疗、人工血管、自体血管搭桥和介入治疗;对于严重的慢性肢体缺血患者，上述治疗方法均有局限性［1-2］。Isner J M 等［3］首先采用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因治疗肢体缺血性疾病并获得成功［3］，为缺血性疾病的治疗提出了新方法。

缺血性疾病的治疗性血管生成是心血管及肢体缺血性疾病的研究热点，其中应用基因治疗的方法，促进血管新生，建立侧支循环，从而改善病变部位缺血状况以达到治疗的目的［4］。本研究采用含低氧反应元件的真核表达载体，诱导VEGF的表达对肢体缺血性疾病进行基因治疗，探索适合缺血性疾病基因治疗的载体。

1 材料和方法

1.1 材料

质粒pcDNA3.1由美国乔治敦大学Pedro A.Jose惠赠;缺氧诱导真核表达载体6HRE-pcDNA3.1-h VEGF165由本室构建，其含有人VEGF的低氧反应元件(hypoxia responsive element，HRE)，经体外细胞实验［5］证实此载体在低氧条件下可使VEGF的表达增强。质粒大量提取试剂盒(Plasmid Mega Kit)为德国Qiagen公司的产品。实验动物为新西兰白家兔40只，雌雄不限，平均体质量3 kg。动物许可证号:(2000)第017号。

1.2 方法

1.2.1 质粒DNA的制备

将质粒pcDNA3.1和缺氧诱导真核表达载体6HRE-pcDNA3.1-h VEGF165分别转化后挑单个菌落接种至5 mL LB培养基中，培养至菌液OD600≈0.6，再将细菌接种到2 000 mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。4℃离心收集细菌。按QIAGEN Plasmid Mega Kit的说明书提取质粒DNA;质粒DNA经酶切鉴定正确后用0.9%氯化钠注射液溶解，调整浓度为1 μg/μL，应用于动物基因治疗的实验研究。

1.2.2 家兔后肢缺血模型的制作

用1%戊巴比妥钠溶液按30 mg/Kg静脉麻醉实验动物，仰卧固定家兔后脱毛并进行消毒;纵行切开左侧大腿正中的皮肤，暴露髂外动脉远端和股动脉，自腹股沟韧带至膝部内侧行左下肢髂外动脉远端和股动脉分支切断剔除术［6］，制作家兔左后肢缺血模型。手术中给予抗生素(头孢拉啶40 mg/Kg)静脉点滴。

1.2.3 基因转移

40只新西兰兔进行血管切断剔除术后立即注射质粒DNA或0.9%氯化钠注射液。将动物采用抽签法随机分成3组，分别给予低氧诱导表达载体质粒6HRE-pcDNA3.1-h VEGF165(VEGF质粒组10只)、pcDNA3.1空载体(空载体组8只)或0.9%氯化钠注射液(0.9%氯化钠注射液组22只)，具体方法为400 μg/kg多点注射于股动脉供血区的大腿肌肉群;VEGF质粒组和空载体组分别注射相应的质粒DNA，0.9%氯化钠注射液组只注射同体积不含质粒的0.9%氯化钠注射液。

1.2.4 临床检测

每只动物于术后进行临床检测，包括观察患肢状况(肢体活动状况、肢体有无溃疡、足趾坏疽、脱落等)、小腿胫动脉血压测量、动脉血管造影、血液生化检测等。

后肢胫动脉血压的测量:使用便携式多普勒超声探测仪测量双侧后肢胫动脉血压，术后3月内每周进行测量。

动脉血管造影:在术后1天、1周、2周、4周、6周和13周进行动脉血管造影。造影前将模型家兔予以常规麻醉、脱毛消毒和固定，手术暴露颈动脉后施行颈动脉插管，经动脉插管快速加压注射造影剂欧乃派克(Omnipaque，奈科明爱尔兰有限公司生产)10 mL，同时用血管造影机(GE公司OEC9800)进行连续拍照，记录血管造影结果。

安全性观察:在手术前(0 d)、术后2周、6周和13周抽取兔静脉血进行丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的检测，观察肝、肾功能的改变。

1.3 统计学方法

使用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差()表示，组间比较采用两因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 肢体缺血模型家兔的肢体状况

所有动物在术后即出现左下肢的跛行，皮肤苍白，皮肤温度低。术后0.9%氯化钠注射液组出现5例感染和6例不同程度的组织坏死;空载体组出现2例感染，1例肢端缺血性坏死;VEGF质粒组未出现伤口感染和肢端缺血性坏死，与对照组(0.9%氯化钠注射液组和空载体组合称对照组)比较，术后肢体状况恢复快。

2.2 后肢小腿胫动脉血压率

所有动物模型，无论VEGF质粒组或对照组，术后用多普勒超声探测仪均测量不到手术侧后肢胫动脉血压，术后1周内2组动物的患侧与健侧胫动脉血压率(L/R)均为0，提示2组动物均出现血管闭塞。VEGF质粒组在术后2周可检测到患肢胫动脉血压，血压率随后逐渐增加，而对照组仍测量不到手术侧胫动脉血压。术后4周，VEGF质粒组和对照组均可检测到患肢胫动脉血压，但VEGF质粒组的胫动脉血压率明显高于对照组(0.66±0.12 vs 0.29±0.13，P＜0.01)。术后6周，VEGF质粒组的胫动脉血压率仍明显高于对照组(0.64±0.15 vs 0.43±0.17，P＜0.05);术后8周，VEGF质粒组的胫动脉血压率明显高于对照组(0.83±0.06 vs 0.64±0.19，P＜0.05);术后约10周，VEGF质粒组的患肢胫动脉血压恢复到正常。对照组于术后21d才可探测到患肢胫动脉的搏动，术后13周胫动脉压恢复正常(表1)。

表1 术后家兔后肢胫动脉血压率Tab.1 Lower limb blood pressure ratio in rabbit ischemic hind limb model after surgery()___________

表1 术后家兔后肢胫动脉血压率Tab.1 Lower limb blood pressure ratio in rabbit ischemic hind limb model after surgery()___________

＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05 vs control;VEGF:vascular endothelial growth factor.

Group Number of case_________________________Lower limb blood pressure ratio(left/right)after operation_________________________1th week 2th week 4th week 6th week 8th week 10th week 12th week 13th week Vegf group 10 0 0.25 ±0.06＊＊ 0.66 ±0.12＊＊ 0.64 ±0.15*0.83 ±0.06*1.03 ±0.12 1.05 ±0.15 0.99 ±0.02 Control 30 0 0 0.29 ±0.13 0.43 ±0.17___0.64 ±0_.19_____0.89 ±0.20___0.96 ±0.23___1.0_______0±0.06

2.3 动脉血管造影

家兔肢体缺血模型术后1d进行动脉血管造影，以其健侧肢体作为对照进行比较，VEGF质粒组与对照组均显示左侧股动脉结扎点远端的动脉缺如形成

盲端，血管充盈显著减慢，侧支循环消失。术后1周，质粒组可见在血管断端附近形成少量微细血管并出现小血管的充盈，血管充盈速度缓慢。术后2周，血管充盈速度仍然缓慢，但明显可见新生血管建立的侧支循环，远端动脉也开始充盈;对照组新生血管数明显少于VEGF质粒组，远端动脉充盈不良，造影结果详见图1。术后4周，血管造影图像显示VEGF质粒组髂内动脉代偿性增粗，股动脉手术缺如区域的血管网重建，动脉充盈速度明显增加，出现许多小血管组成的侧支循环，血管数明显多于对照组;对照组动脉充盈速度仍然明显慢于健侧动脉，小血管组成的侧支循环少，血管充盈不够充分(图1)。

图1 家兔肢体缺血动物模型14d和28d血管造影结果Fig.1 Angiograms of rabbit ischemic hind limb model on 14 days and 28 days after surgery

2.4 血液生化检测

家兔肢体缺血动物模型的血液生化检测结果与国内外研究［7-8］所测定的正常结果比较，给予含VEGF的质粒DNA后，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)的检测结果均在正常范围内(表2)。正常值范围分别为:ALT(IU/L)25.56～79.66，AST(IU/L)31.09～88.93，CR(mg/L)1.4～16.6，BUN(mg/L)81～250。

表2 术后家兔血液生化检测Tab.2 Biochemical values in rabbit blood after surgery(n=18)

3 讨论

慢性肢体缺血性疾病可引起患者肢体疼痛、皮肤溃疡、间歇性跛行等症状，甚至因肢体缺血性坏死而截肢，导致肢体残疾，严重影响患者的生活质量，目前尚缺乏有效的临床治疗措施［1］。自20世纪以来，国内外许多研究者［3，8］采用治疗性血管生成的基因治疗方法，获得了一定的疗效。

基因治疗中需要解决的关键问题包括治疗性基因的选择、基因载体、基因转移的途径等。基因载体是关系到基因治疗成败的较为关键的因素，其分为病毒载体和非病毒载体［10］。由于病毒载体可能引起机体严重的免疫反应，病毒DNA非特异性整合至宿主基因组可能导致宿主基因功能失调，甚至可能引起恶性肿瘤的发生［11］，因此，非病毒载体更为引人关注。非病毒载体中，使用裸DNA的方法具有DNA制备简单、毒性低、免疫反应轻微、基因可以有效表达等优点，是临床基因治疗研究中采用较多的最为简单的方法［4］。

基因治疗中有关载体的另一关键问题是缺乏可调控性基因表达载体。治疗性基因的精确调控仍是目前基因治疗中具有挑战的问题;研究较多的调控系统是天然或人工合成的增强子－启动子系统，可被某些因素诱导，如热冲击、低氧、电离辐射、某些化学试剂等。常用于缺血性疾病基因治疗的调控系统是低氧调控系统，常含有低氧反应元件(HRE)，当组织缺血或低氧时可使转录因子低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)表达增加，其作用于表达载体的HRE，诱导基因表达。使用可调控的基因表达系统除可调控基因表达外，还可显著地降低潜在的安全隐患，尤其是对慢性疾病的基因治疗［12］。在缺血性疾病的基因治疗中，VEGF是有效的血管生成因子之一，如果使用可调控性表达载体，调控VEGF基因的表达，可避免在正常组织中由于VEGF大量表达所引起的不良反应，如内皮细胞来源的血管肿瘤、组织水肿等［13］。

本实验采用自行构建的含VEGF基因和低氧反应元件(HRE)的低氧诱导真核表达载体，使用裸DNA直接肌肉注射的基因转移方法进行了家兔肢体缺血模型的基因治疗，初步观察了此载体在家兔肢体缺血模型的治疗作用;实验结果说明此载体对家兔肢体缺血模型具有促进血管生成的作用，术后胫动脉压恢复也早于对照组，血管造影结果显示VEGF质粒组血管代偿性增粗，手术缺如区域的血管网重建，患肢的新生血管生成和侧支循环形成的时间均早于对照组，故具有一定的治疗作用;基因治疗期间家兔模型未出现明显的肝肾功能损害。虽然肌肉内直接注射裸DNA后转染和表达效率低，但肌肉组织可摄取质粒DNA，在注射局部基因可有效表达，此方法具有毒性低、组织损伤小、简便等优点，并且基因可在肌肉组织持续表达数月也已被大量动物实验和临床实验［4，14-15］所证实，因此本实验采用裸DNA直接肌肉注射的方法是肢体缺血性疾病基因治疗的常用方法。

治疗性基因表达的严格调控可使治疗性基因的表达控制在特定的细胞、组织或器官内，可有效地降低不良反应的发生，是基因治疗中亟须解决的问题。开发可调控的基因表达系统和组织特异性的基因表达调控系统，可显著降低基因治疗中的危险因素，无论在缺血性疾病、神经退行性变等慢性疾病，或是肿瘤的基因治疗中都是至关重要的，随着相关理论与技术的发展，将会研究出更安全有效的基因治疗载体，使缺血性疾病的基因治疗能产生更好的效果。

［1］Bendermacher B L，Willigendael E M，Teijink J A，et al.Medical management of peripheral arterial disease［J］.J Thromb Haemost，2005，3(8):1628-1637.

［2］Sontheimer D L.Peripheral vascular disease:diagnosis and treatment［J］.Am Fam Physician，2006，73(11):1971-1976.

［3］Isner J M，Pieczek A，Schainfeld R，et al.Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of ph-VEGF165 in patient with ischaemic limb［J］.Lancet，1996，348(9024):370-374.

［4］Bobek V，Taltynov O，Pinterova D，et al.Gene therapy of the ischemia lower limb-Therapeutic angiogenesis ［J］.Vascul Pharmacol，2006，44(6):395-405.

［5］殷爱红，武文琦，何丽明，等.低氧诱导人基因表达载体的构建及其蛋白表达检测［J］.山东医药，2011，51(52):48-50.

［6］Pu L Q，Jackson S，Lachapelle K J，et al.A persistent hindlimb ischemia model in the rabbit［J］.J Invest Surg，1994，7(1):49-60.

［7］Hewitt C D，Innes D J，Savory J，et al.Normal biochemical and hematological values in New Zealand white rabbits［J］.Clin Chem，1989，35(8):1777-1779.

［8］俞纯方，邓云翔.家免血液生理生化指标与生产力的关系:对8个品种家兔血液的测定与分析［J］.重庆师范学院学报:自然科学版，1996，13(2):51-55.

［9］王家宁，张群林，葛永贵，等.血管内皮细胞生长因子基因治疗严重肢体缺血［J］.中国动脉硬化杂志，2001，9(4):328-331.

［10］张凤兰，文朝阳，丁卫.腺相关病毒基因治疗载体的改良与应用［J］.首都医科在学学报，2009，30(4):565-573.

［11］Gǒrecki D C.“Dressed-up”naked plasmids:emerging vectors for non-viral gene therapy［J］.Discov Med，2006，6(35):191-197.

［12］Guo Z S，Li Q，Bartlett D L，et al.Gene transfer:the challenge of regulated gene expression［J］.Trends Mol Med，2008，14(9):410-418.

［13］Lee R J，Springer M L，Blanco-Bose W E，et al.VEGF gene delivery to myocardium:deleterious effects of unregulated expression［J］.Circulation，2000，102(8):898-901.

［14］付爱玲.裸DNA治疗研究［J］.生命的化学，2009，29(3):327-329.

［15］Tongers J，Roncalli J G，Losordo D W.Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia:microvascular therapies coming of age［J］.Circulation，2008，118(1):9-16.