顺铂联合索拉非尼协同抑制三阴性乳腺癌细胞的体外研究

姚舒洋，樊 英，徐兵河

三阴性乳腺癌 (triple－negative breast cancer，TNBC)即雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)均表达为阴性，约占新诊断乳腺癌的15%。这类疾病具有相似的特征、极高的同源性，组织分化差，多属于基底样乳腺癌，与乳腺癌1号基因 (BRCA1)相关性乳腺癌具有较多相似性［1－2］。TNBC患者发病年龄早，易早期局部复发和远处转移，增殖指数高［3－4］，无病生存时间和总生存时间均较短，预后不佳，目前国内外仍缺乏针对该特殊类型乳腺癌的规范化治疗指南。虽然TNBC缺乏内分泌治疗和抗HER2治疗的靶点，然而其他分子靶向药物正在进行体内外治疗研究［5］。目前单药索拉非尼对TNBC细胞体外抑制作用的研究不多，且尚无分子靶向药物联合顺铂 (DDP)体外治疗TNBC的报道。因而本研究观察DDP联合索拉非尼对TNBC细胞的抑制作用，探索治疗TNBC的新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 选用人乳腺癌细胞株MDA－MB－231、MDAMB－468、CAL－51于本实验室保存。培养传代在含10%新生牛血清的DMEM培养基中，选择指数生长期细胞进行实验。索拉非尼 (德国拜耳公司)溶解于二甲基亚砜 (DMSO)制成浓度为10 mM的溶液，分装保存于－20℃冰箱备用，加药时用DMEM培养基稀释至目标浓度，使终溶液中的DMSO浓度＜0.5%。DDP购自山东齐鲁制药厂，DMEM购自GIBCO公司，MTT购自 Sigma公司，Anti－ERK1/2、Anti－p－ERK1/2、Anti－β－Actin、Anti－JNK、Anti－p－JNK购自Santa Cruz Biotechnology公司，Anti－Rabbit及Anti－Mouse购自Promega公司。

1.2 实验分组 实验细胞分为空白对照组、索拉非尼单药组、DDP单药组、DDP联合索拉非尼组。检测细胞增殖抑制率时DDP单药剂量分别为5、10、50、100 M，索拉非尼单药剂量分别为1、2、5、10 M，DDP联合索拉非尼组药物剂量是4+2、8+4、10+5、12+6、14+7 M。检测MAPK通路关键蛋白时，各组中索拉非尼剂量均为5 M，DDP剂量均为10 M。

1.3 MTT法检测细胞生长抑制率 MDA－MB－231、MDAMB－468、CAL－51细胞接种在96孔培养板中，每孔接种5 000细胞，设3个平行孔。培养24 h后加入药物。加入不同剂量的DDP，或 (和)索拉非尼继续培养48 h，倾去培养基，加入用无血清DMEM培养基配制的0.5 g/ml MTT 100μl，继续培养4 h，弃培养基，然后加入DMSO 200μl，摇床20 min，充分溶解后，立即用酶标仪测定吸光度 (OD)值，计算细胞增殖抑制率。肿瘤细胞生长抑制率=1－〔该药物处理组平均A值－空白对照组A值〕/〔细胞对照组平均A值 (阴性对照) －空白对照组A值〕×100%。实验重复3次。采用各组抑制率均数，经生物软件CalcuSyn计算不同药物作用48 h的半数抑制浓度 (IC50)、两药联用时IC50的变化以及不同浓度的两药联合作用于各种细胞的协同系数 (combination index，CI)。CI＞1为拮抗作用，CI=1为相加作用，CI＜1为协同作用，且CI值越小，表示药物协同效应越强。

1.4 Western blot分析 Anti－ERK1/2、Anti－p－ERK1/2、Anti－β－Actin、Anti－JNK、Anti－p－JNK蛋白表达 取生长状态良好的细胞，待细胞密度达到60%～70%，分别加培养基，10μM DDP，5μM索拉非尼，以及10μM DDP联合5μM索拉非尼作用48 h，收集培养液。刮取细胞于试管中，3 000 r/min离心5 min，收集细胞于Ep管中，加入适量蛋白裂解液，离心20 min，取上清－70℃备用。样品预先用Bradford法定量，每孔上样50μg总蛋白于12%分离胶和5%浓缩胶SDS－PAGE凝胶电泳;蛋白转移至PVDF膜;室温下5%牛奶封闭1 h，一抗 (Anti－ERK1/2、Anti－p－ERK1/2、Anti－β－Actin、Anti－JNK、Anti－p－JNK，按1∶1 000稀释)4℃过夜，二抗 (Anti－Rabbit及Anti－Mouse，按1∶2 000稀释) 室温下孵育1 h，曝光，显影，定影。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行统计分析，计量资料以 ()表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量的DDP、索拉非尼和DDP联合索拉非尼对各细胞株生长抑制率比较 MTT法检测不同剂量的DDP对MDAMB－231、MDA－MB－468、CAL－51细胞株生长抑制率比较，差异均有统计学意义 (p＜0.05)。DDP对各细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，随剂量的增加，其对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，组间两两比较差异均有统计学意义 (p＜0.05)。同一浓度药物作用下各细胞株生长抑制率比较，差异均有统计学意义 (p＜0.05，见表1)。

不同剂量索拉非尼对MDA－MB－231、MDA－MB－468、CAL－51细胞株生长抑制率比较，差异均有统计学意义 (p＜0.05)。索拉非尼对各细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，随剂量增加，其对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，组间两两比较差异均有统计学意义 (p＜0.05)。MDA－MB－231、MDAMB－468、CAL－51细胞株在索拉非尼1 M和10 M时的生长抑制率比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05);在2 M和5 M时的生长抑制率比较，差异均有统计学意义 (p＜0.05，见表2)。

表1 不同剂量DDP对各细胞株生长抑制率比较 (，%)Table 1 Inhibitory effects of DDPof different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

表1 不同剂量DDP对各细胞株生长抑制率比较 (，%)Table 1 Inhibitory effects of DDPof different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

浓度(M)例数MDA－MB－231 MDA－MB－468 CAL－51 F值P值5 3 19.9±8.7 56.1±5.5 38.6±5.5 21.578 0.002 10 3 34.8±6.9 82.2±2.6 48.2±9.0 44.536 0.000 50 3 54.8±8.9 90.3±3.8 73.5±9.3 15.850 0.004 100 3 74.6±0.8 92.3±3.7 86.3±1.8 40.661 0.000 F 35.298 50.804 29.002 P值值0.000 0.000 0.000

表2 不同剂量索拉非尼对各细胞株生长抑制率比较 (，%)Table 2 Inhibitory effects of Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

表2 不同剂量索拉非尼对各细胞株生长抑制率比较 (，%)Table 2 Inhibitory effects of Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

浓度(M)例数MDA－MB－231 MDA－MB－468 CAL－51 F值P值1 3 6.5±1.2 5.1± 1.8 7.4±2.8 0.935 0.443 2 3 15.9±1.0 13.7± 0.7 22.1±3.0 16.155 0.004 5 3 22.1±5.3 44.6± 4.3 38.4±4.5 18.273 0.003 10 3 71.1±2.1 77.8±14.9 82.5±1.8 1.287 0.343 F 287.493 53.376 316.906 P值值0.000 0.000 0.000

不同剂量DDP联合索拉非尼对MDA－MB－231、MDAMB－468、CAL－51细胞株生长抑制率比较，差异均有统计学意义 (P=0.000)。DDP联合索拉非尼对各细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，随剂量增加，其对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，组间两两比较差异均有统计学意义 (P=0.000)。在同一浓度药物作用下各细胞株生长抑制率比较，差异均有统计学意义 (p＜0.05，见表3)。

2.2 不同剂量的DDP和索拉非尼对不同乳腺癌细胞株的CI按照药物协同作用中效原理，利用CalcuSyn软件计算得出的药物作用48 h不同剂量的DDP和索拉非尼的CI值均＜1(见表4)。

2.3 不同组MAPK关键蛋白的表达情况 经DDP单药处理48 h后的各细胞的ERK、p－ERK、JNK的表达较空白对照组无明显不同;索拉非尼单药和联合DDP处理48 h后的各细胞p－ERK的表达明显受到抑制;DDP单药处理48 h后MDAMB－231和MDA－MB－468细胞的p－JNK表达较空白对照组明显升高，但p－JNK表达不如索拉非尼单药和联合DDP处理后升高明显，且联合组的表达量明显大于两个单药组。索拉非尼单药或联合DDP处理48 h后CAL－51细胞的p－JNK表达亦明显升高，但索拉非尼单药和联合DDP处理后p－JNK的表达没有明显不同 (见图1)。

表3 不同剂量DDP联合索拉非尼对各细胞株生长抑制率比较，%)Table 3 Inhibitory effects of DDPcombined with Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

表3 不同剂量DDP联合索拉非尼对各细胞株生长抑制率比较，%)Table 3 Inhibitory effects of DDPcombined with Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

浓度(M)例数 MDA－MB－231 MDA－MB－468 CAL－51 F值 P值4+2 3 13.3±1.8 63.3±1.1 63.3±2.3 789.075 0.000 8+4 3 35.0±0.5 73.5±1.9 77.4±0.9 973.047 0.000 10+5 3 47.2±1.6 79.0±1.5 84.7±0.9 643.047 0.000 12+6 3 57.2±1.6 81.1±0.4 87.4±1.8 368.377 0.000 14+7 3 61.3±1.9 87.8±3.2 93.3±1.1 178.638 0.000 F 458.280 73.351 172.469 P值值0.000 0.000 0.000

表4 不同剂量的DDP和索拉非尼对不同乳腺癌细胞株的CITable 4 Combination index(CI)of different concentrations of DDP andSorafenib on four kinds of breast cancer cell lines

图1 索拉非尼或 (和)DDP作用MDA－MB－231，MDA－MB－468和CAL－51细胞48 h后，对MAPK信号通路蛋白的影响Figure 1 Effect on MAPK signaling pathway proteins 48 h after application of Sorafenib or/and cisplatin on MDA－MB－231，MDA－MB－468 and CAL－51 cells

3 讨论

TNBC是乳腺癌中最富有挑战性的，目前最主要的治疗措施仍为全身化疗，但其预后依然很差。索拉非尼是一种口服的多激酶抑制剂，能抑制RAF、c－KIT、VEGFR－2、VEGFR－3、PDGFR－、FLT3等激酶的活性［6］。在多种肿瘤包括肝癌［7］、甲状腺癌［8］、胃肠间质瘤［9］的临床研究中均显示出确切的抗肿瘤增殖的活性。DDP是一种类烷化剂的金属铂类化合物，BRCA1相关性乳腺癌对铂类药物相当敏感。本研究首次进行了索拉非尼单药或 (和)联合DDP体外治疗TNBC的研究。MTT结果表明DDP与索拉非尼单药对3种TNBC细胞株的体外生长均有抑制作用，且抑制率随着药物剂量增加而增加，具有剂量效应依赖关系。这表明两药联用达到对乳腺癌细胞同样的抑制作用时所需药物剂量较其单独应用时极大降低，这对于临床用药时降低药物剂量，减少毒副作用具有重要的意义。因此，本研究MTT结果支持了生物化疗这一肿瘤治疗新模式的先进性，联合用药取得了更好的肿瘤细胞增殖抑制作用。与单药相比，联合用药进一步提高了疗效，而且减少各单药的用药剂量，因而可能减少药物的毒副作用，提高耐受性。

经10多年对DDP与MAPK信号途径的研究认为，MAPK是细胞对DDP反应的重要调节因素。JNK活化可以增强细胞对DDP的敏感性，减轻DDP的耐药性［10－11］。本研究中仅发现MDA－MB－231细胞DDP单药组p－JNK表达较对照组明显升高，而ERK、p－ERK和JNK的表达较对照组无明显变化;3种细胞经DDP单药处理48 h后ERK、p－ERK、JNK和p－JNK的表达较对照组均无明显变化。DDP单药对MDAMB－468和CAL－51细胞的抑制作用可能不是通过影响ERK和JNK通路起作用。在联合用药中发现，DDP能协同增强索拉非尼对JNK的磷酸化，这说明DDP能协同增强索拉非尼对JNK通路的激活，从而进一步诱导凋亡。MDA－MB－468细胞的联合用药组p－ERK明显低于索拉非尼单药组，说明DDP能协同抑制ERK的磷酸化，抑制ERK通路的活性，从而抑制细胞的增殖。但是在其他细胞的联合组中没有观察到DDP联合索拉非尼对ERK通路有协同抑制作用。

Liu等［7］研究发现，索拉非尼通过抑制人肝癌细胞株HepG2的RAF/ERK通路，使MEK和ERK的磷酸化水平下降，下调CyclinDl，使增殖期细胞不能通过“G1－S”调节点，影响细胞增殖促进凋亡。Wei等［12］研究发现索拉非尼联合维生素K能在体外通过抑制p－ERK和Bcl－2的表达，增加p－JNK、c－Jun和FALS的表达，促进胰腺癌细胞的凋亡。本研究发现索拉非尼单药和联合DDP处理各细胞株，均能见到p－ERK的表达较空白对照组和DDP单药组明显降低，p－JNK的表达明显升高。只在MDA－MB－468细胞的联合用药组发现，p－ERK的表达明显低于索拉非尼单药组。原因可能是索拉非尼单药对ERK通路的抑制能力太强，使p－ERK明显减低，而使DDP协同索拉非尼抑制ERK的表达作用无法显现，可能降低索拉非尼的剂量能更好观察二者的协同作用。因此，ERK通路抑制及JNK通路的激活是两药联合增效的部分机制。

本研究的意义在于首次发现DDP联合索拉非尼在体外能协同抑制多种TNBC细胞株的增殖，并初步阐明分子机制，为该方案的临床应用提供了理论依据。

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