Graves病患者血浆热休克蛋白70水平变化及其意义

李霞绯，李 强，陈紫君，刘 纯

热休克蛋白 (heat shock protion，HSP)是一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质分子家族，普遍存在于原核和真核细胞中，从细菌到哺乳动物体内均可见其表达［1］。人们发现缺血、缺氧、重金属、病毒感染、恶变等刺激均可引发细胞的应激反应，从而合成HSP，故又称为应激蛋白［2］。已有研究发现，Graves病 (Graves disease，GD)患者甲状腺［3］以及Graves眼病 (Graves ophthalmopathy，GO)患者球后成纤维细胞上［4］都有HSP70的过量表达，且参与了疾病的自身免疫过程。越来越多的研究显示，细胞内HSP70可以进入细胞外环境参与许多疾病的发生发展，在某些疾病患者的循环血液中也检测到高于正常人水平的HSP70，如心肌梗死［5］、动脉粥样硬化［6］等，并且血液中细胞外HSP70水平与疾病的炎症反应密切相关。细胞外HSP70能通过古老的TOLL样受体 (toll like receptors，TLRs)信号途径激活巨噬细胞、单核细胞和树突细胞，HSP70和TLRs结合后，所激活的下游信号转导途径和白介素1受体 (interleukin－1 receptor，IL－1R)基本相同，均通过信号转导级联反应MyD88→IRAK→TRAF6/ECSIT→NIK/IKK，引起核转录因子κB(nuclear factor－κB，NF－κB)的活化，最终引起巨噬细胞、单核细胞和树突细胞释放炎性细胞因子［7］。本研究旨在通过检测GD患者血浆中HSP70及炎性因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF－α)的水平变化以及GD患者外周血单个核细胞内炎症信号通路的起始点TLR及终末点NF－κB的基因表达，来探讨细胞外HSP70在GD发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年3—7月我院内分泌门诊确诊的GD初发患者25例 (病例组)，其中男8例，女17例;平均年龄 (33.9±6.7)岁;同时收集本院25例健康体检者 (对照组)，其中男8例，女17例;平均年龄 (34.4±6.3)岁。病例组符合第7版《内科学》GD诊断标准:有典型甲状腺功能亢进症状、体征，伴有游离三碘甲状腺原氨酸 (FT3)、游离甲状腺素 (FT4)水平升高，促甲状腺素 (sTSH)水平降低及甲状腺过氧化物酶抗体 (TPO－Ab)和 (或)甲状腺球蛋白抗体 (Tg－Ab)、促甲状腺素受体抗体 (TRAb)升高，均未接受过抗甲状腺药物治疗。研究对象均排除近期感染史、妊娠、精神创伤、剧烈运动以及合并心血管慢性疾病、肿瘤、类风湿等与自身免疫有关的疾病。血液标本采自禁食12 h以上的静脉血，并及时离心分离血清，放置－20℃保存。

1.2 方法 血清HSP70、TNF－α和TRAb采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法测定，外周血单个核细胞TLR4及NF－κB的mRNA表达用反转录聚合酶链反应 (RT－PCR)测定，试剂盒分别由武汉中美科技和R＆D提供。丙二醛 (MDA)采用比色法测定，试剂盒由南京生物建成提供。FT3、FT4、sTSH、TPO－Ab、Tg－Ab采用化学发光法测定，由重庆医科大学附属第一医院内分泌实验室测定。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件包进行统计检验。计量资料以表示，组间比较采用t检验;相关分析采用等级相关法 (Pearson法)。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 病例组患者血浆HSP70、TNF－α、MDA水平均显著高于对照组，差异有统计学意义 (p＜0.05，见表1)。

表1 病例组与对照组受检者血浆HSP70、TNF－α、MDA水平比较Table 1 Comparison of levels of HSP70，TNF－α，MDA in GD and normal controls

表1 病例组与对照组受检者血浆HSP70、TNF－α、MDA水平比较Table 1 Comparison of levels of HSP70，TNF－α，MDA in GD and normal controls

注:HSP70=热休克蛋白70，TNF－α=肿瘤坏死因子α，MDA=丙二醛

组别 例数 HSP70(ng/L)TNF－α(ng/L)MDA(μmol/L)病例组25 168±101 27.5±12.1 7.22±0.91对照组 25 42± 18 7.1± 2.6 4.04±0.57 t 值6.144 4.62 12.809 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05

2.2 相关分析显示，病例组GD患者血浆HSP70水平与TNF－α、MDA、FT3、FT4呈正相关，与 sTSH呈负相关 (p＜0.05);血浆HSP70水平与TPO－Ab、Tg－Ab、TRAb无相关性 (P＞0.05，见表2)。

表2 病例组GD初发患者血浆HSP70水平与各因素的相关性Table 2 Relationship between HSP70 with TNF－α，MDA，hyroid function and autoimmune antibodies in GD patients

2.3 病例组患者外周血单核细胞TLR4 mRNA表达量 (0.185±0.006)显著高于对照组 (0.081±0.039)，差异有统计学意义 (t=13，p＜0.01);NF－κB mRNA表达量 (0.73±0.049)亦显著高于对照组 (0.31±0.039)，差异有统计学意义 (t=31，p＜0.01)。

3 讨论

GD患者甲状腺［3］以及GO患者球后成纤维细胞上［4］都有HSP70的过量表达，且提示细胞内HSP70参与了疾病的发生。本研究结果显示，GD患者血浆中HSP70水平显著高于健康者，提示GD患者细胞外HSP70水平上升;同时，与健康者比较，GD患者血浆氧化应激产物MDA及炎性细胞因子TNF－α水平也有显著升高，而且GD患者血浆HSP70水平与TNF－α、MDA水平呈正相关。其实活性氧族和炎性细胞因子均可诱导细胞内HSP70的过量表达［8］。而且炎性细胞因子可以诱导HSP70的细胞外释放［9］。另外，氧化应激也被认为参与了锻炼诱导的循环HSP70升高，并且用维生素C和维生素E能抑制其升高［10］。应激诱导的细胞外HSP70能作为一个细胞内的应激信号分子，提示细胞应激或损伤，从而引出先天免疫和获得性炎症免疫反应［11］。HSP70激活细胞内炎症信号通路主要是通过与细胞表面TLR结合，激活的下游信号转导途径和IL－1R基本相同，均通过信号传导级联反应MyD88→IRAK→TRAF6/ECSIT→NIK/IKK，引起NF－κB的活化，最终引起巨噬细胞、单核细胞和树突细胞释放炎性细胞因子并最终激活NF－κB来完成的［7］。有研究者用“危险理论”［12］来解释其功能:应激所产生的细胞外HSP70可能作为一种“危险信号”促进机体的免疫功能，从而帮助清除病原体。在急性炎症时，细胞外HSP70通过TLR2和 (或)TLR4激活免疫细胞，产生一氧化氮和其他炎性因子，促使病原物的清除和炎症的减退。而在慢性炎症性疾病时，应激诱导的细胞外HSP70使炎性因子水平持续过度升高，反而导致病情恶化。GD的发病机制已公认主要与免疫因素有关，其病理损伤实际上是一种免疫炎性反应过程［13］。本研究发现血浆中HSP70和TNF－α水平均显著高于健康者，并且血浆HSP70水平与TNF－α及甲状腺功能相关。而且GD患者外周血单个核细胞上炎症反应链的起始点TLR4和终末环节NF－κB的mRNA表达均较健康者显著增加。提示内源性细胞外HSP70可能通过TLR4激活细胞内信号通路，引起NF－κB的活化，最终引起巨噬细胞、单核细胞和树突细胞释放炎性细胞因子，从而激活和加剧GD的炎症反应。

细胞外HSP70除了刺激炎性因子的产生，还能促进抗原呈递细胞 (antigen－presenting cell，APC)的成熟和迁移，以及APC和T淋巴细胞的相互作用，从而引发获得性免疫反应［14］。细胞外HSP70能在抗原加工过程中与抗原肽结合，形成的HSP－肽复合物经坏死或濒死细胞释放后与APC上的受体结合，抗原通过HSP被递送给主要组织相容性复合体－I［15］，同样说明HSP能够刺激获得性免疫反应。GD是一种自身免疫性疾病，体液免疫和细胞免疫均参与了GD的发病。本研究还发现GD患者血浆中升高的HSP70与TPO－Ab、Tg－Ab、TRAb不相关，提示GD患者体内自身免疫反应是一个复杂的病理过程，其变化可能与个体自身的免疫过程有关，同时提示细胞因子间有着非常复杂的相互作用关系，细胞因子的网络失调可能造成了GD的发生发展。

总之，升高的血浆HSP70水平反映了GD的系统炎症和疾病的严重程度，但需要更进一步的研究来证实血浆HSP70在GD中的免疫调节作用。

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