PML-RARα245-hIL-2双基因表达载体的构建和表达研究

胡刚，岑东芝，杨力建，陈少华，周羽竝，李扬秋，4

(1.广东省惠东县人民医院内一科，广东 惠东 516300;2.暨南大学医学院血液病研究所;3.暨南大学医学院生物化学教研室;4.暨南大学再生医学教育部重点实验室)

近年来研究显示:利用白血病细胞特异抗原如染色体易位所形成的融合基因构建疫苗诱导产生特异抗白血病免疫效应，对清除残留白血病细胞，提高疗效有重要价值［1－3］。我们前期的研究中已经利用长度为384 bp的PML-RARα基因片段成功地构建了PML-RARα384-hIL-2真核双表达质粒［4］，为了对比包含不同抗原表位的不同长度PML-RARα基因片段的DNA疫苗的免疫效果，我们尝试构建了包含不同长度PML-RARα片段 (245 bp)的PML-RARα-hIL-2真核双表达质粒，并证明其体外成功表达。

1 材料与方法

1.1 材料 pIRES质粒、Jurkat细胞以及NB4细胞株由本实验室保存，DH5α感受态菌株购自北京天为时代公司，内切酶和连接酶购自大连宝生(TaKaRa)生物公司，Taq酶购自Promega公司，PHA购自深圳晶美公司，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.2 PCR扩增 从NB4细胞株中提取RNA逆转录合成cDNA作为模板 (NB4细胞的RNA提取和cDNA合成均按常规方法进行)，PP1和PP2作为引物扩增出PML-RARα部分基因。总反应体积为20μl，其中含2μl cDNA和1U聚合酶 (Promega)，其余各试剂的终浓度为:引物0.5μmol/L，dNTP 0.1mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，1 ×Buffer。反应在PCR扩增仪 (BioMetra)中进行。反应条件:首先94℃ 3 min，然后94℃1 min，56℃ 1 min，72℃1 min循环30次，最后72℃ 6 min。扩增产物 (标记为PCR1)。从经过PHA刺激24h后的Jurkat细胞中提取总RNA逆转录合成cDNA作为模板，以P5和P6作为引物进行扩增，以扩增产物为模板再用P3和P4扩增出hIL-2全长基因。两次扩增反应体积相同，具体如下:总反应体积为20μl，其中含2μl cDNA和1U聚合酶(Promega)，其余各试剂的终浓度为:引物0.5 μmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，1×Buffer缓冲液。反应在PCR扩增仪 (BioMetra)中进行。两次扩增反应条件相同，具体如下:首先94℃ 3 min，然后94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min循环30次，最后72℃ 6 min。所扩增产物 (标记为PCR2)用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒纯化后备用。

1.2.3 pIRES-PML-RARα245重组质粒的构建和鉴定 将纯化后的PCR1用Nhe I和Mlu I(TaKaRa)进行双酶切后与经过同样酶切处理的pIRES质粒利用T4 DNA连接酶 (TaKaRa)连接后，转化DH5α感受态菌。用Nhe I/Mlu I双酶切筛选出含有245 bp外源插入片段的阳性克隆pIRES-PMLRARα245。

1.2.4 p IRES-PML-RARα245-h IL-2重组质粒的构建和鉴定 将纯化后的PCR2用Sal I和Not I(TaKaRa)进行双酶切后与经过同样酶切处理的pIRES-PML-RARα245重组质粒利用T4 DNA连接酶连接后，转化DH5α感受态菌。用Sal I/Not I双酶切筛选出含有487 bp的外源插入片段的阳性克隆 p IRES-PML-RARα245-hIL-2。同时构建 pIRES-hIL-2重组质粒作为对照。

1.2.5 重组质粒DNA序列分析 1μl质粒DNA用于直接序列分析，应用非放射性、双脱氧核苷酸末端终止法和Big-Dye Terminator cycle sequencing ready reaction试剂盒及3100 DNA测序仪(ABI，Perkin Elmer)进行序列分析。

1.2.6 转染真核细胞后在转录和翻译水平进行检测 利用LipofectamineTM2000 Kit转染A549细胞，收集转染后培养48 h的A549细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA作为模板，分别用引物 PP1，PP2(用于扩增PML-RARα基因，245 bp)和P3，P4(用于扩增hIL-2基因，487 bp)进行PCR扩增，PCR产物于琼脂糖凝胶电泳观察结果。收集转染后培养48 h的A549细胞上清液，冷冻浓缩干燥后作为样品，用于点杂交和ELISA检测hIL-2蛋白在A549细胞中的表达情况。

2 结果

2.1 目的基因的扩增 从NB4细胞的cDNA中扩增出PML-RARα基因片段，其大小为245 bp，以Jurkat细胞cDNA为模板进行巢式PCR，扩增hIL-2基因，PCR产物大小为487 bp，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，产物大小与预期结果相符。

图1 PML-RARα基因与hIL-2基因PCR产物电泳图M:Marker;1:PML-RARα基因PCR产物(245 bp);2:hIL-2基因PCR产物(487 bp)

2.2 重组质粒的构建及鉴定 构建的p IRES-PMLRARα245重组质粒经过Nhe I和Mlu I双酶切鉴定证明有大小为245 bp的外源插入片段。构建的pIRES-PML-RARα245-hIL-2重组质粒经过Sal I和Not I进行双酶切鉴定证明有大小为487 bp的外源插入片段 (图2)。

图2 p IRES-PML-RARα245和 p IRES-PML-RARα245-hIL-2重组质粒双酶切鉴定M:Marker;1:p IRES-PML-RARα245/Nhe I+Mlu I2:p IRES-PML-RARα245-hIL-2/Sal I+Not I

2.3 序列分析结果 测序结果证实重组质粒中外源插入片段分别与GenBank中PML-RARα基因和hIL-2基因序列完全一致，重组质粒中 PMLRARα245基因片段部分测序结果见图3。

图3 p IRES-PML-RARα245-hIL-2重组质粒序列分析结果

2.4 转录水平检测外源质粒在真核细胞中的表达转染后培养48 h的A549细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA作为模板，分别用于扩增PMLRARα基因和hIL-2基因，PCR结果显示转染了各种重组质粒的A549细胞的cDNA中均含有相应的目的基因，提示这些质粒都已经成功地转染到了A549细胞中，并且能够在细胞中进行正常转录。

2.5 点杂交结果 收集转染后培养48 h的A549细胞上清液，冷冻浓缩干燥后作为样品，用于点杂交实验检测hIL-2蛋白在A549细胞中的表达情况。转染了 p IRES-PML-RARα245-hIL-2和 p IRES-h IL-2的A549细胞培养上清液点杂交结果均为阳性，说明 pIRES-PML-RARα245-hIL-2和 pIRES-hIL-2重组质粒能够在A549细胞中表达hIL-2蛋白，并且该蛋白能够与hIL-2抗体发生特异结合。

2.6 ELISA结果 加入转染了pIRES-PMLRARα245-h IL-2的 A549细胞上清液和转染了pIRES-hIL-2的A549细胞上清液的孔在加入显色剂孵育15 min后呈现出明显的肉眼可见的蓝色，说明这两种上清液中含有重组质粒表达的hIL-2蛋白;其余标本孔均未出现显色反应，说明这些标本中不含有hIL-2蛋白，这与预期结果是一致的，说明重组质粒已经成功的转染了A549细胞，并且能够在细胞中正常地表达hIL-2蛋白 (图4)。

图4 ELISA检测结果A:转染了pIRES-PML-RARα245的A549细胞上清液 B:转染了pIRES-PML-RARα245-hIL-2的A549细胞上清液 C:转染了p IRES-hIL-2的A549细胞上清液;D:转染了pIRES的A549细胞上清液，E:未转染任何质粒的A549细胞上清液

3 讨论

利用融合基因构建DNA疫苗用于治疗白血病，是当前研究的热点。表达BCR-ABL融合基因的细胞和表达BCR-ABL融合基因的DNA疫苗，可以体外诱导特异性抗白血病效应［1，5］。许多急性早幼粒细胞白血病患者体内存在t(15;17)(q22;q21)，形成PML-RARα融合基因。我们通过研究发现含有PML-RARα融合基因的细胞可诱导T细胞克隆性增殖［6］，该现象提示PML-RARα融合蛋白可以被MHC分子加工提呈，因此可以利用PML-RARα融合基因诱导产生针对APL细胞的特异性免疫应答。Osman等利用PML-RARα融合蛋白诱导 PML-RARα肽特异的 CD4+或 CD8+CTL［2］。Padua等应用 PML-RARα 融合基因制备的DNA疫苗在小鼠体内诱导出了特异性免疫保护作用［3］。IL-2具有活化和促进B细胞分化，活化NK细胞和单核细胞，以及促进T细胞分化和释放淋巴因子等多种生物学作用，能够显著增强DNA疫苗的免疫原性，达到增强疫苗保护效果的目的［7］。DNA疫苗的免疫效果与目的基因的片段所包含的基因序列与片段大小是有一定关系的，如何筛选出合适的抗原片段是DNA疫苗的研发的一个重要内容，我们在前期的研究中已经成功地构建了PML-RARα384-hIL2真核双表达质粒，并证明其能诱导小鼠体内免疫应答，但效应还有待进一步提高［4，8］。为了比较包含不同长度PML-RARα 基因片段的DNA疫苗的免疫效果，本研究尝试构建了包含245 bp的PML-RARα245-hIL2真核双表达质粒，证明了该克隆的正确性，并且该质粒能够在真核细胞中正常转录并翻译出相应的蛋白。该研究的进一步目的在于筛选出用于构建DNA疫苗的合适的PML-RARα基因片段，并将进一步探讨联合多个疫苗免疫治疗的可能性，从而为治疗APL的DNA疫苗研发提供更丰富的资料。

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