缺氧诱导因子-1α在垂体腺瘤中的表达及其临床意义

李 强，莫业和，刘运生

垂体腺瘤是临床常见的颅内肿瘤，绝大多数呈组织学良性表现，但仍有一部分呈侵袭性生长，导致手术完全切除困难，术后容易复发，目前仍是临床治疗的难点和重点。缺氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α) 是普遍存在于人和哺乳动物细胞内的缺氧应答调控因子，在调节缺氧诱导的基因表达中发挥重要作用，并且与肿瘤的侵袭和转移密切相关［1］。本研究通过检测HIF-1αmRNA和蛋白在垂体腺瘤中的表达情况，探讨HIF-1αmRNA和蛋白的表达与垂体腺瘤侵袭性的关系。

1 资料与方法

1．1 一般资料 收集2006年4—9月中南大学湘雅医院神经外科垂体腺瘤手术标本42例，其中男20例，女22例;年龄16～60岁，平均40．6岁，均经手术和病理学确诊。鞍膈或鞍底硬脑膜送病理学检查，明确是否存在肿瘤细胞浸润。肿瘤最大直径11～20 mm者7例，21～30 mm者14例，31～40 mm者9例，＞40 mm者12例。符合下列情况之一者可确定为侵袭性垂体腺瘤:(1)Hardy-Wilson分级为Ⅲ级及Ⅲ级以上和C-E期;(2)Knosp分级3级以上;(3)术中见鞍区骨质破坏，海绵窦内壁穿通，窦内结构被肿瘤包绕;(4)病理证实鞍膈或鞍底硬脑膜有肿瘤细胞侵润。42例患者中侵袭性垂体腺瘤27例 (64．3%)，非侵袭性腺瘤15例 (35．7%)。

1．2 方法

1．2．1 标本处理 肿瘤标本均取自肿瘤中心部位。取绿豆大小肿瘤标本数块，0．9%氯化钠溶液洗净积血，立即放入经焦碳酸二乙酯 (DEPC)水处理过的冻存管中，置液氮中保存。

1．2．2 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)检测垂体腺瘤HIF-1αmRNA的表达 Trizol裂解细胞后提取总RNA，取1μl测光密度 (OD)值，DNA消化。使用日本Toyobo公司试剂盒逆转录体系进行cDNA合成。引物 (上海生工生物技术服务有限公司)序列如下:HIF-1α上游:5′-AAA GAC CGT ATG GAA GAC-3′; 下游:5′-CAA AGCGACAGA TAA CAC-3′;β-actin为内参照，上游:5′-CTG TCT GGC GGC ACC ACC AT-3′; 下游:5′-GCA ACT AAG TCA TAC TCC GC-3′。多聚酶链式反应 (PCR) 体系:cDNA 2μl，Taq酶0．2μl，总反应体系20μl。PCR循环条件:95℃预变性3 min;以94℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次;72℃延伸7 min，4℃终止反应。1．5%的琼脂糖凝胶电泳，将凝胶在Eagle Eye-Ⅱ型图像分析系统上分析计算。测出HIF-1α扩增带的OD值，并以β-actin扩增带的OD值作为参照，得出HIF-1α与β-actin OD值比较的相对比值。

1．2．3 免疫组化检测垂体腺瘤HIF-1α蛋白的表达 一抗为鼠抗人HIF-1α单克隆抗体，购自加拿大Chemicon公司，链霉卵白素—过氧化物酶 (SP)免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺 (DAB)显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，免疫组化操作按试剂盒说明进行。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，已知阳性组织切片作阳性对照。参照Birner等［2］方法进行半定量分级，高倍镜下随机选取5个视野，以阳性细胞率和染色强度的得分之和进行判断。阳性细胞率＜10%记为阴性，不论其染色深浅，记1分;阳性细胞率11% ～50%记2分，51% ～80%记3分，＞80%记4分。染色强度呈弱染色 (浅黄色)记1分，中等染色 (棕黄色)记2分，强染色 (黄褐色)记3分。上述两项积分之和为3分者为弱阳性 (+)，4～5分者为中等阳性 (++)，6～7分者为强阳性 (+++)。

1．3 统计学方法 采用SPSS 11．0统计软件进行统计学分析，计量资料以 (±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 侵袭组和非侵袭组垂体腺瘤中HIF-1α蛋白的表达 非侵袭组垂体腺瘤中HIF-1α蛋白表达阳性例数为9例，阳性率为60．0%(9/15);侵袭组垂体腺瘤中HIF-1α蛋白表达阳性例数为26例，阳性率为96．3% (26/27)，两组阳性率比较，差异有统计学意义 (χ2=9．15，P=0．005，见图 1、表1)。

2．2 侵袭组和非侵袭组垂体腺瘤中HIF-1αmRNA的表达HIF-1αmRNA在侵袭组的表达量为 (0．298±0．094)，在非侵袭组的表达量为 (0．241±0．079)，两组比较差异无统计学意义 (t=1．041，P=0．329，见图 2)。

图1 HIF-1α在垂体腺瘤中的表达 (SP×200)Figure 1 Expression of HIF-1α in pituitary adenomas(SP×200)

表1 两组垂体腺瘤HIF-1α蛋白表达情况比较 (例)Table 1 Comparison of protein expression of HIF-1αin pituitary adenomas between two groups

图2 HIF-1αmRNA 在垂体腺瘤中的表达Figure 2 mRNA expression of HIF-1αin pituitary adenomas

2．3 不同大小肿瘤HIF-1α蛋白的表达 根据影像学测定垂体腺瘤的最大直径进行比较，垂体腺瘤直径10～30 mm者HIF-1α蛋白表达阳性例数为14例，阳性率为70．0%;直径＞30 mm者HIF-1α蛋白表达阳性例数为21例，阳性率为95．5%，两组阳性率比较差异有统计学意义 (χ2=4．89，P=0．041，见表2)。

表2 不同大小垂体腺瘤标本HIF-1α蛋白表达情况比较 (例)Table 2 Comparison of protein expression of HIF-1αin pituitary adenomas with different diameter

3 讨论

垂体腺瘤是颅内常见的实体性肿瘤，绝大多数组织学上呈良性表现，但常向鞍上和鞍旁海绵窦内生长，甚至突破鞍底骨质，向蝶窦内生长，表现出类似恶性肿瘤侵袭的特征。因此，单纯从影像学上难以正确评价垂体腺瘤的生物学行为。

近年来许多研究表明，肿瘤侵袭行为的产生与HIF-1α表达和稳定性增加有关，HIF-1α在肿瘤细胞中的表达情况可对肿瘤的恶性程度及侵袭行为的改变进行判断和预测［3］。

本研究发现，HIF-1α在垂体腺瘤中有明显表达，其表达部位主要位于细胞核，细胞质中也可有少量表达，这与国外的研究结果一致［4］。本研究还发现，在垂体腺瘤发生囊变坏死区域的周边组织以及肿瘤血管分布稀疏的地方，HIF-1α表达较高。一般认为，距离血管100～200μm以外的区域即处于缺氧环境中，大部分肿瘤组织氧分压低于2．5 mm Hg(1 mm Hg=0．133 kPa)，而正常脑组织则为 24 ～ 66 mm Hg［5］，说明缺氧可能是诱导HIF-1α蛋白表达及稳定的重要因素。

Semenza［6］及 Sharp 等［7］研究发现，缺氧对 HIF-1α 蛋白表达的影响体现在转录、翻译和转录后等多个过程，其中对转录后即在蛋白质水平的调节是其主要的调控方式。Secades等［8］也发现，肿瘤组织在缺氧早期即有HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白的增加，并对其下游靶基因的表达进行调控，从而影响肿瘤的侵袭性。本研究发现，HIF-1α蛋白在侵袭组垂体腺瘤中表达的阳性率高于非侵袭组，而HIF-1αmRNA在侵袭组和非侵袭组垂体腺瘤中表达则无差异，这表明缺氧对垂体腺瘤组织中HIF-1α蛋白表达的影响主要发生在转录后蛋白质水平。

此外，本研究对不同大小垂体腺瘤中HIF-1α蛋白的表达情况也进行了分析，结果显示，垂体腺瘤直径＞30 mm者HIF-1α蛋白表达阳性率较高。有研究表明，氧在肿瘤组织中的弥散不超过10个细胞的距离，除此之外，其他部位呈现相对或绝对缺氧状态［9］。随着肿瘤体积的增大，上述情况加重，主要原因可能与肿瘤的微血管数目相对不足有关。以往研究已经证实，垂体腺瘤的微血管密度低于正常垂体组织［10-11］。HIF-1α蛋白在直径＞30 mm的垂体腺瘤中具有较高程度的表达，这可能与垂体腺瘤中微血管数目的相对不足所导致的肿瘤组织缺氧有关。

综上所述，HIF-1α蛋白在侵袭性垂体腺瘤中的表达增加，并且在垂体腺瘤侵袭行为产生的过程中可能发挥重要的作用。

1 陶晓峰，刘畅．缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子与肝细胞癌分化及其侵袭性的相关性研究［J］．中国全科医学，2011，14(1):164．

2 Birner P，Schindl M，Obermair A，et al．Overexpression of hypoxiainducible factor 1alpha is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cancer［J］．Cancer Res，2000，60(17):4693-4696．

3 Ruan K，Song G，Ouyang G．Role of hypoxia in the hallmarks of human cancer［J］．JCell Biochem，2009，107(6):1053-1062．

4 Vidal S，Horvath E，Kovacs K，etal．Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha(HIF-1alpha)in pituitary tumors［J］．Histol Histopathol，2003，18(3):679-686．

5 Belozerov VE，Van Meir EG．Hypoxia inducible factor-1:a novel target for cancer therapy［J］．Anticancer Drugs，2005，16(9):901-909．

6 Semenza GL．Regulation ofmammalian O2homeostasis by hypoxia-inducible factor 1 ［J］．Annu Rev Cell Dev Biol，1999，15:551-578．

7 Sharp FR，Bernaudin M．HIF1 and oxygen sensing in the brain ［J］．Nat Rev Neurosci，2004，5(6):437-448．

8 Secades P，Rodrigo JP，Hermsen M，etal．Increase in gene dosage is a mechanism of HIF-1alpha constitutive expression in head and neck squamous cell carcinomas ［J］．Genes Chromosomes Cancer，2009，48(5):441-454．

9 Kaur B，Khwaja FW，Severson EA，et al．Hypoxia and the hypoxiainducible-factor pathway in glioma growth and angiogenesis［J］．Neuro Oncol，2005，7(2):134-153．

10 李通，幸兵，任祖渊．侵袭性垂体腺瘤血管增殖相关因子研究进展［J］．国际神经病学神经外科学杂志，2009，36(1):37-40．

11 潘力雄，刘运生，陈忠平．微血管密度及血管内皮生长因子表达与垂体瘤侵袭性的关系 ［J］．中华神经外科杂志，2003，19(4):285-287．