靶向干扰细胞周期检验点激酶2增强5-氟尿嘧啶对鼻咽癌细胞SUNE-1的毒性作用研究

潘 宇, 蔡 飒, 朱杰宁, 林秋熊, 余细勇



靶向干扰细胞周期检验点激酶2增强5-氟尿嘧啶对鼻咽癌细胞SUNE-1的毒性作用研究

潘 宇1, 蔡 飒2, 朱杰宁1, 林秋熊1, 余细勇1

（1广东省人民医院, 广东省医学科学院医学研究中心, 广州 510080;2深圳大学医学院组织胚胎学教研室, 深圳 518060）

探讨靶向抑制细胞周期检验点激酶2（Chk2）对5-氟尿嘧啶（5-FU）抗鼻咽癌鳞状上皮细胞SUNE-1的增敏作用。根据Chk2基因设计siRNA干扰序列, 在mRNA和蛋白水平检测其干扰效果; 通过细胞生长曲线观察Chk2 siRNA对SUNE-1细胞增殖能力的影响; 通过细胞毒性试验检测Chk2 siRNA是否影响SUNE-1细胞对代谢类抗肿瘤药5-FU的敏感性; 采用AnnexinⅤ/PI双染方法检测细胞凋亡的变化情况。所采用的siRNA在mRNA和蛋白水平均显著降低SUNE-1细胞中Chk2表达, 验证了该siRNA的干扰效果; Chk2 siRNA对SUNE-1细胞增殖能力无显著影响, 但能显著增强5-FU的细胞毒作用（＜0.05）; 细胞凋亡检测结果显示, Chk2 siRNA显著增加5-FU引起的SUNE-1细胞凋亡水平。尽管Chk2对SUNE-1细胞生存和增殖不发挥关键作用, 但在5-FU引起的细胞损伤中对细胞起保护作用, 该作用与其抑制5-FU引起的细胞凋亡有关, 因此Chk2可成为在鼻咽癌治疗中增强5-FU的疗效的靶点。

抗肿瘤药; 鼻咽癌; 5-氟尿嘧啶; 细胞周期检验点激酶; RNA干扰

作为目前常用的广谱抗肿瘤药之一, 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）广泛用于治疗多种实体肿瘤, 如鼻咽癌、消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等。5-FU属尿嘧啶抗代谢药, 其药理作用主要是通过抑制细胞DNA的合成, 引起DNA受损, 从而干扰肿瘤细胞的增殖。然而与多数肿瘤化疗药相似, 5-FU具有骨髓抑制等多种毒副作用, 可在用药期间诱发患者严重不良反应。如何增加恶性肿瘤细胞对于该类化疗药物敏感性、增强药效、减少用药剂量和毒副反应的发生一直是抗肿瘤治疗研究的重要课题[1]。

细胞周期检验点是机体细胞应答DNA损伤的主要机制之一, 其作用是在细胞增殖周期中保证DNA的完整性。DNA损伤可激活细胞周期检验点, 进而导致周期阻滞和DNA修复。对于恶性肿瘤细胞来说, 细胞周期检验点介导DNA损伤修复的作用可降低化疗药物对细胞的杀伤作用, 进而导致肿瘤耐药[2-5]。因而, 以细胞周期检验点或DNA修复机制中关键蛋白为靶点的肿瘤治疗策略可克服细胞周期检验点对化疗药物作用的影响, 从而增加肿瘤对DNA损伤剂的敏感性[6,7]。

细胞周期检验点激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2, Chk2）在细胞周期检验点中非常关键, 通常对于DNA双链断裂等类型的损伤有较明显的应答作用, 有关Chk抑制剂增加肿瘤细胞对DNA损伤剂敏感性的研究亦受到广泛关注[8,9]。本文通过抑制Chk2表达, 观察其对5-FU抗鼻咽癌细胞的细胞毒性影响。

1 材料与方法

1.1 药品

5-FU购于Sigma公司。鼻咽低分化鳞状上皮细胞癌细胞系SUNE-1由中山医科大学肿瘤研究所惠赠, 本室保存, 以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液, 37℃、5% CO2培养。

1.3 RNA干扰序列设计

根据GenBank中提供的Chk2基因序列设计针对Chk2的siRNA序列（广州锐博生物有限公司合成）: 5'-GAACCTGAGGACCAAGAACdTdT-3'; 选择不针对任何基因的siRNA序列（mock siRNA）作为阴性对照: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’。

1.4 细胞转染:

使用Lipofect AMINETM2000脂质体（Life Technologies公司, 美国）进行转染, 所有操作按产品说明书进行。转染后48 h进行基因干扰效果测定。

1.5 细胞生长抑制实验

采用磺酰罗丹明B（Sulforhodamine, SRB）法检测药物的细胞毒作用。将处于对数生长期的贴壁细胞以200μL/孔接种于96孔培养板, 贴壁生长24 h后转染siRNA, 后于37℃、5% CO2条件下培养48 h。取出培养板, 每孔加入50％（m/V）的三氯乙酸50µl固定细胞, 4℃放置l h。弃固定液, 用蒸馏水洗涤5次, 空气中自然干燥。每孔加SRB溶液100 µl, 室温下放置10～30 min。去上清液, 1%醋酸洗涤5次, 空气干燥。最后加入150 μl/孔的Tris溶液, 于平板振荡器上振荡5min。酶联免疫检测仪（Model3550, Bio-Rad）于515nm处测定OD值。设置三个复孔。

1.6 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡

根据Annexin V/PI双染试剂盒说明书（Biovision公司, 美国）进行操作, 流式细胞监测仪检测AnnexinⅤ阳性的凋亡细胞。

1.7 Western blot方法检测Chk2表达

细胞转染siRNA 48 h和72 h后, 用PBS冲洗2遍, 加入细胞裂解液, 4℃裂解20 min, 12 0004℃离心15 min, 收集上清液, Bradford法测蛋白浓度。将样品加入到样品槽中, 进行电泳。电泳完毕后, 在半干转膜仪上转膜。之后, 依次室温振摇封闭2 h、一抗室温孵育2 h、相应的二抗孵育1 h。洗膜后化学发光增强剂进行显影。以b-actin作为内参对照。

1.8 RT-PCR方法检测Chk2 mRNA水平

细胞转染siRNA 48 h和72 h后, 采用TRIzol（Invitrogen公司, 美国）提取总RNA, 紫外分光光度计测定RNA的浓度和质量。采用Super-ScriptTM一步法RT-PCR试剂盒（Invitrogen公司, 美国）对mRNA水平进行检测。反应体系为25 μl, 扩增反应时加入总RNA 1 μg作为模板。反应条件如下: 50℃×

30 min反转录, 之后94℃×30 s, 56℃×30 s, 72℃×45 s, 39个循环, 最后延伸反应72℃×10 min。以GAPDH作为内参对照。反应完成后将产物进行琼脂糖电泳, 凝胶成像仪照相并分析结果。RT-PCR引物如下: GAPDH上游引物5¢-CGGAGTCAACGGA-TTTGGTCGTAT-3¢, GAPDH下游引物5¢-GTCTT- CACCACCATGGAGAAGGCT-3¢; Chk2上游引物5¢-ATGTCTCGGGAG TCGGATGT-3¢, Chk2下游引物5¢-TCTTGCTGTATGTTCGGTAT-3¢。

1.9 统计学处理

采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SUNE-1细胞中Chk2 siRNA干扰效果检测

将Chk2 siRNA转染SUNE-1细胞, 48 h后通过RT-PCR方法检测细胞内Chk2 mRNA水平, Western Blot法检测蛋白的表达水平, 从而明确干扰效果。结果表明, Chk2 siRNA序列可显著降低细胞中Chk2的mRNA与蛋白水平, 而mock siRNA不影响细胞内Chk2水平（图1）。

2.2 Chk2 siRNA对SUNE-1细胞增殖的影响

将siRNA转染后的细胞接种到24孔板中, 设置三个复孔, 每天计数各组细胞数, 至转染后6 d。结果显示, Chk2 siRNA对细胞增殖能力无显著影响（＞0.05; 图2）。

图1 Chk2 siRNA干扰效果检测

Figure 1 Knockdown effect of Chk2 siRNA

A: Chk2 mRNA; B: Chk2蛋白

图2 Chk2 siRNA对SUNE-1细胞增殖作用的影响

Figure 2 Effect of Chk2 siRNA on proliferation of SUNE-1

2.3 Chk2 siRNA增加SUNE-1细胞对5-FU的敏感性

将siRNA转染SUNE-1细胞后, 用不同浓度5-FU（0.05, 0.25, 1.25, 6.25 µmol/L）处理细胞后48 h收集细胞, 检测不同siRNA对5-FU细胞毒性的影响。结果显示, Chk2干扰可增强5-FU对SUNE-1细胞的细胞毒作用。说明Chk2在5-FU诱导激活的DNA损伤应答中发挥重要作用, 抑制Chk2可增加SUNE-1细胞对5-FU的敏感性（图3）。

2.4 Chk2 siRNA增加5-FU引起的SUNE-1细胞凋亡

将siRNA转染SUNE-1细胞后, 以5-FU处理细胞, 48 h后收集细胞, 进行AnnexinⅤ/PI双染检测细胞凋亡水平。结果显示, Chk2 siRNA单独处理并不引起SUNE-1细胞发生细胞凋亡, 但是可以显著增强5-FU引起的细胞凋亡水平（图4）。

图3 Chk2 siRNA显著增强SUNE-1对5-FU的敏感性

Figure 3 Chk2 siRNA significantly enhanced sensibility of SUNE-1 to 5-FU

与正常细胞比较,*＜0.05,**＜0.01; 与mock siRNA处理细胞比较,#＜0.05,##＜0.01

图4 Chk2 siRNA对5-FU致SUNE-1细胞凋亡的影响

Figure 4 Effect of Chk2 siRNA on SUNE-1 apoptosis induced by 5-FU

A: 流式细胞仪检测细胞凋亡; B: 细胞凋亡百分比。与正常细胞比较,*＜0.05,**＜0.01; 与mock siRNA处理细胞比较,#＜0.05,##＜0.01

3 讨 论

细胞对DNA损伤的应答主要是通过ATR/ ATM-Chk1/2细胞周期检验点通路来调节[3]。ATM和ATR是周期检验点网络中主要的上游信号传递分子, 属于PI3K类激酶（phosphoinositide 3- kinase- like kinase, PI3K）家族成员。活化的ATM进一步激活Chk1/2及其下游激酶, 进而导致周期阻滞。作为细胞周期检验点中的关键激酶, Chk1和Chk2在细胞DNA损伤的应答反应中具有重要作用, 因此抑制其功能有利于提高DNA损伤剂对于细胞的杀伤毒性[7-9]。然而, Chk抑制剂对特定DNA损伤剂是否具有增敏作用与DNA损伤剂类型、肿瘤细胞系等多种因素有关[10-15]。5-FU作为一种抗代谢类抗肿瘤药, 在多种肿瘤细胞中被证明可激活Chk2, 因此我们选择5-FU来研究抑制Chk2对其的增敏作用。

本研究中, 我们通过siRNA干扰有效地抑制了Chk2在人鼻咽癌鳞状上皮细胞癌细胞株SUNE-1中的表达。Chk2干扰并未显著影响细胞的增殖速度和细胞增殖能力, 亦未导致细胞凋亡, 这与其他成体细胞中的结果相符[16-18], 说明Chk2在细胞正常增殖过程中并不发挥主要作用, 因此, 对Chk2的抑制性治疗不会对正常细胞产生危害, 为这种治疗策略提供了支持。而Chk2干扰明显增加了SUNE-1细胞对5-FU的敏感性, 且该作用与5-FU所致的细胞凋亡诱导抑制有关, 这可能是因为Chk2抑制造成细胞周期检验点异常, 使之不能有效修复5-FU造成的DNA损伤, 从而导致细胞对DNA损伤敏感性增强, 这说明, Chk2在5-FU引起的细胞损伤中对细胞起保护作用, 而Chk2可成为鼻咽癌治疗中增强5-FU疗效的靶点。本研究为以细胞周期检验点蛋白为靶点的5-FU抗肿瘤增敏疗法提供了依据, 为提高该类化疗药物的疗效、减少毒副反应奠定了分子生物学基础。

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（编辑: 任开环）

Enhanced sensitivity of nasopharyngeal carcinoma SUNE-1 cells to 5-FU by Chk2 knockdown

PAN Yu1, CAI Sa2, ZHU Jiening1, LIN Qiuxiong1, YU Xiyong1

(1Research Center of Medical Sciences, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital, Guangzhou 510080, China.2Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)

To investigate the chemosensitization of Chk2 inhibition to 5-FU against nasopharyngeal squamous epithelial cell line SUNE-1.Chk2 siRNA was designed according to the mRNA sequence of Chk2, and its effect was confirmed by RT-PCR and Western blotting in SUNE-1 cells. Cell growth assay was evaluated to determine the impact of Chk2 siRNA on the proliferation ability of SUNE-1 cells and MTT assay was used to determine the chemosensitization of Chk2 siRNA to 5-FU. Finally, apoptotic cells was stained with AnnexinⅤ/PI and examined by flow cytometry.Chk2 siRNA significantly reduced mRNA and protein levels of Chk2 in SUNE-1 cells, which confirmed the knockdown effect of Chk2 siRNA. Cell growth assay showed that Chk2 siRNA did not influence the proliferation of SUNE-1 cells. However, Chk2 knockdown significantly enhanced the cytotoxicity and apoptosis of SUNE-1 cells caused by 5-FU.Chk2 hinders the toxic effect of 5-FU on SUNE-1 cells, which can be enhanced by Chk2 inhibition. Therefore, Chk2 can be proposed as a target to increase the effect of chemotherapeutic agent, such as 5-FU, in clinical treatment onnasopharyngeal carcinoma.

antineoplasitc agents; nasopharyngeal carcinoma; 5-FU; Chk2; RNA interference

(81000835, 81000011)(10451018201004913)

R730.53

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00053

2012-02-14;

2012-03-14

国家自然科学基金(81000835, 81000011); 广东省自然科学基金(10451018201004913)

余细勇, Tel: 020-83827812, E-mail: yuxycn@hotmail.com