非培养技术在干酪微生物群落分析中的应用

莫蓓红，孙立国

(光明乳业股份有限公司乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436)

非培养技术在干酪微生物群落分析中的应用

莫蓓红，孙立国

(光明乳业股份有限公司乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436)

非培养方法在食品行业中的应用还处于起步阶段。本文综述非培养方法在分析干酪中微生物群落结构以及监测微生物群落结构在干酪生产和成熟过程中演替的应用现状。主要介绍已被广泛用于分析干酪中微生物群落结构的DNA指纹图谱技术，包括PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术、PCR-时间温度梯度凝胶电泳(PCR-TTGE)技术、单链构象多态性PCR(SSCP-PCR)技术以及变性高效液相色谱(DHPLC)技术等。此外，本文还对非培养技术的优点和局限性进行分析，展望非培养方法在干酪行业的应用前景，认为将非培养方法和传统培养方法结合使用才是研究微生物生态的最好途径。

非培养方法；干酪；DNA指纹图谱技术；微生物群落

干酪的制作可追溯到8000年前，那时的中东人发明了世界上第一种牛奶发酵食品[1]。发展至今，干酪拥有1000多种不同的形式和口味，在世界各地都广受欢迎[2]。绝大多数干酪都是由牛奶、凝乳酶、食盐和微生物菌种这些基本原料通过酸化、凝乳、排乳清和成熟等工艺步骤制得的。特性不一的各类干酪就是通过不同的原料组合或者工艺参数改变得到的。微生物群落的组合和活性是所有这些参数中最不容易控制的。因为干酪的微生物群落中不仅包括乳酸菌发酵剂，而且还包括非发酵剂乳酸菌，其他细菌、酵母和丝状真菌等二级微生物群落。二级微生物群落在干酪的制作和成熟过程中是不断发展变化的，这对干酪的物理和化学特性的改变起到了很大的作用。由于干酪制作和成熟过程中的各个阶段都会对其中的微生物组成形成选择压力，因此产生了微生物群落的演替[3]。虽然所有食品中微生物群落的多样性都毋庸置疑的不及环境(例如土壤)中的微生物群落，但是复杂的动力学变化和相互作用使得干酪中的微生物群落变得难以控制。如果能够充分了解干酪中微生物群落的结构和动力学变化，那么人们就能够更加了解干酪中微生物的生长和代谢是如何改变干酪特性的。例如，通过控制微生物的组成或者改变其中某种或某些种类微生物的数量，以得到更佳的某种感官特性或者预防质量缺陷和酸败等。目前为止，人们已经通过传统的培养方法以及少量的分子生物学技术对干酪中的细菌和真菌群落进行了部分鉴定。

同其他环境一样，干酪中的微生物可以通过传统的培养方法和非培养法进行种水平上的鉴定。传统的培养方法要求必须先对微生物进行分离培养获得纯培养，然后再通过菌落形态、生化特性或者基因特性进行鉴定。经过多年发展，基于培养的分析方法已经在分析干酪制作过程中的微生物群落结构方面发挥了重要的作用。然而，培养方法耗时很长，而且培养技术复杂繁冗，需要针对不同种类的微生物设计不同的培养基和培养方法。因此无法胜任监测干酪制作和成熟过程中微生物群落多样性的任务。此外，一些数量较低的菌种在分离培养过程中会由于优势种群的生存竞争而无法生长[4]，还有一些菌种无法用现有的技术获得分离培养[5-7]。因此培养依赖方法的群落分析结果无法准确表征实际的微生物群落，甚至有时会曲解其中的微生物多样性。

对于群落中的微生物是如何在它们的自然生境中共同生存和生长方面的认识还非常有限，而且目前也没有一种培养基能够完全模拟微生物群落的生存环境，因此必须要使用非介入性的非培养方法。随着分子生物学的不断发展，环境微生物群落的分析越来越依赖于基于DNA(或RNA)基因序列分析技术的非培养方法。非培养技术的根本在于从样品中直接提取总DNA(或RNA)，再加上后继的基因指纹图谱技术等整体性分析，就能够克服传统的培养方法所带来的弊端，使人们能够更加接近环境中微生物的真实群落结构和多样性。这类方法更加快速而准确，更加适合于分析微生物群落随时间的演替，使得人们能够详尽研究干酪中微生物的群落动力学。

1 非培养技术及其在干酪微生物群落分析中的应用

非培养技术是以微生物的核酸(基因组DNA或RNA)序列信息为依据，通过分析环境样品中核酸分子的种类和数量来反映该群落中微生物的种类和数量。由于每种微生物细胞都具有其独特的核酸分子，其序列组成也有各自独特的特征，因此，通过直接从环境样品中提取所有微生物的核酸(基因组总DNA或RNA)，依据核苷酸序列的不同，分析这些DNA或RNA的种类和相对数量，就可以反映出微生物的种类组成以及数量比例情况，从而对微生物的群落结构得到一个比较客观、全面的认识。

1.1 基因克隆文库分析

不经纯培养，直接提取环境样品中微生物细胞的总基因组DNA，环境基因组总DNA是环境中各种微生物基因组的混合物，通过分析微生物基因组DNA的组成可以反映样品中微生物种类组成，这是因为微生物的基因组DNA序列具有种属特征，可以成为识别和鉴定微生物种属地位的可靠指标。但由于环境样品中微生物DNA的组成过于复杂，不宜直接对这些DNA混合物进行序列分析。一般需与特定的PCR方法相结合，通过对扩增得到的带有进化信息或某种功能信息的标记基因的组成进行分析，而推知整个系统的组成结构。理论上，从干酪样品中提取总DNA，然后通过构建克隆文库对不同的克隆基因片段进行测序，就能够获得样品中微生物真实的群落结构。不过这需要进行大规模的克隆和测序以确保其中所有的物种都被测序，即使克隆测序的成本在逐年下降，但如果作为日常基本的分析方法仍显得十分昂贵。在已有的相关文献[8-10]报道中，这种测序的方法仅仅作为一种其他分析技术的补充手段被应用于干酪微生物群落分析。例如Carraro等[11]2010年将传统培养法、实时定量PCR分析法与构建16S克隆文库测序法相结合，测定了Montasio干酪在制作过程中微生物群落结构的演替变化。结果显示，S. thermophilus是整个Montasio干酪成熟过程中的优势乳酸菌种。同时Pseudomonasspp.和Lactococcus piscium存在于干酪成熟的起始阶段。

1.2 DNA指纹图谱分析

基于基因克隆文库分析的限制因素，另外一类不需要大规模克隆测序的分子分析方法得到了广泛应用。即基于凝胶电泳或色谱原理的DNA片断指纹图谱分析法。这些方法的基本原理和在干酪微生物群落分析中的应用简介从以下几个方面来阐述。

1.2.1 PCR-变性梯度凝胶电泳和PCR-时间温度梯度凝胶电泳

传统的核酸电泳分离主要是依据分子的大小和所带电荷的多寡，当待分离核酸的长度相同或相近时，很难达到分离的目的。而变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)不是基于核酸分子质量的不同将DNA片断分开，而是根据序列的不同，将片断大小相同但碱基组成不同的DNA序列分开。当双链DNA分子在含梯度分布的变性剂(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，因其解链的速度和程度与其序列密切相关，所以具有不同序列的DNA片断就会滞留于凝胶的不同位置，结束电泳时，形成相互分开的带谱。然而一旦双链DNA完全解链成单链DNA，它们又能在胶中继续迁移，从而影响电泳结果。因此，为了调节目的序列的解链行为，在PCR扩增目的片断时，需在某一引物的5＇端人为地加上一段约40个富含GC碱基的序列，称之为“GC帽”或“GC夹子”(GC-clamp)，它的解链温度很高，因此可以防止DNA片断的完全解链，从而提高DNA片断在DGGE/TGGE胶中的分离效果。理论上认为，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、温度范围、电泳时间、电压等足够精细，有一个碱基差异的DNA片断都可被分开。时间温度梯度凝胶电泳(temporal temperature gradient gel electrophesis，TTGE)与DGGE原理类似，只是不需化学变性剂的梯度，用恒定的变性剂浓度制胶，在电泳过程中缓冲液的温度逐渐升至最高，因此，电泳过程的变性环境是由凝胶中恒定浓度的变性剂和逐渐升高的电泳温度共同完成，快速而高效，相比DGGE具有更高的可重复性。

PCR-DGGE由Fischer等[12]于20世纪80年代初期发明，最初主要用于检测DNA突变。1993年Muyzer等[13]首次将该技术应用于复杂微生物群落的研究，此后10年，众多研究者运用变性-温度梯度凝胶电泳(DGGE-TTGE)技术进行了大量环境微生物群落结构的研究工作，该项技术已经发展成了一项主要的微生物分子生态学分析方法。PCR-DG/TTGE也是目前在乳制品特别是干酪产品微生物群落研究中应用最为广泛的分子分析技术[14-16]。PCR-DGGE技术的优势在于图谱中的电泳条带能够直接从丙烯酰胺凝胶中提取并测序，因此也可以对任何感兴趣的条带进行测序，通过与数据库中的已知序列对比获得更多的信息。

近年来，PCR-DG/TTGE技术已经被成功地用于研究多种手工奶酪中细菌群落的多样性、生物活性以及制作工程中的生物动力学变化。干酪中的复杂微生物生态系统由细菌、酵母和霉菌组成，其中细菌是奶酪生产过程中的主要的群体，2002年Ogier等[15]用PCR-TTGE技术对奶酪中细菌群落结构进行了研究，通过对主要条带测序分析发现有Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Enterococcus、Pediococcus、Streptococcus和Staphylococcus属的成员存在。Randazzo等[17]于2002年使用PCR-DGGE技术研究了微生物群落在Ragusano干酪生产和成熟过程中的动力学变化，并对多种不同Ragusano手工干酪中的微生物群落结构进行了对比。结果表明，手工干酪中微生物群落的多样性较使用商业化发酵剂生产的干酪要更加复杂。同样的方法也被应用于揭示细菌群落结构在Pecorino Siciliano干酪的整个生产过程中的动力学变化，对Pecorino Siciliano干酪成品的研究表明其中最主要的优势菌群为Streptococcus bovis和L. lactisspecies[18]。2005年Florez等[19]运用PCR-DGGE技术和传统培养技术对蓝纹干酪Spanish blue-veined Cabrales Cheese)中的微生物群落进行了研究，两种方法的结果基本一致，不过通过对DGGE图谱中条带的测序表明97%的序列来自已知的可培养种群，而另外的3%则为未被培养的种群。2010年Alegria等[20]同样运用PCR-DGGE的方法和传统的培养方法分别研究了蓝纹干酪中微生物群落在制作和成熟过程中的组成和变化。Streptococcus thermophilus在非培养方法中被检测到而在培养方法中则未被检测到。在其他主要微生物的群落结构和演替方面，两种研究方法的结果非常接近。这些发现表明合理运用非培养的分子生物学技术可以获得传统培养方法所不能得到的信息。PCR-DGGE和传统培养方法的研究结果也并非总是非常相似，Kafili等[21]2009年研究伊朗传统Lighvan干酪的微生物群落结构时发现，虽然PCR-DGGE和培养法的结果都显示Lactococcus lactis和Lactobacillusspp.为优势菌，但在研究Lactobacillus属中具体的优势种时两种方法的结果出现了差异。PCR-DGGE显示Lactobacillus curvatus和Lactobacillus sakei为优势种，而培养法显示Lactobacillus paraplantarum，Lactobacillus paracasei，Lactobacillus brevis和Lactobacillus plantarum为可培养的优势种。2010年Alessandria等[22]同样用PCR-DGGE和培养法研究了Planalto de Bolona干酪中的微生物群落结构，在表征真菌群落时培养方法显示Candida属为整个制作过程中的优势真菌，而PCR-DGGE的结果显示Aureobasidium pullulans是真菌群落中的优势菌。

1.2.2 单链构象多态性PCR技术

单链构象多态性PCR(single-strand conformation polymorphism，SSCP-PCR)技术的理论基础是单链DNA具有序列特异性的二级结构，序列组成上的差异(至少1个碱基的差异)也会影响这种二级结构，而这种变化可以通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得到。分析样品时，双链DNA首先要变性为单链后，再上样电泳分析，不同的DNA单链由于其二级结构不同，就会电泳到不同的位置，从而进行分离，得到群落结构图谱。SSCP-PCR技术本来是用于临床鉴定基因突变，近年来被应用到微生物生态学的研究[23-24]。SSCP-PCR技术相比PCR-DG/TTGE技术可以同时分析更多的样品，分析更加容易和快速，因为它不需要构建电泳梯度，也不用添加GC夹子。因此SSCP-PCR技术更加适合用于分析环境中微生物群落在不同时间或空间条件下的群落结构演替。

近年来，该技术被用来分析干酪样品中的微生物群落结构以及干酪生产和成熟过程中微生物群落结构的演替。如Duthoit等[25]用16S rRNA基因的SSCP对奶酪生产过程中细菌群落结构的动态变化进行了分析研究，发现从3个农民提供的3份样品得到的图谱显著不同。Saubusse等[26]运用SSCP-PCR技术通过对不同干酪样品中微生物群落的分析来区别其中的微生物群落是否具有抑制沙门氏菌生长的功能。结果表明，通过对16S rRNA基因的V2区片断进行SSCP分析，能够将用同种工艺生产的不同干酪样品区别开，然后再通过与具有抑制沙门氏菌微生物的分析图谱进行对比，就能判断出其是否对沙门氏菌具有抑制作用。此外，Callon等[27]运用SSCP技术成功对3种传统Registered Designation of Origin (R.D.O.) Salers cheeses中的酵母菌群落结构进行了分析。通过与传统培养方法的对比表明SSCP分析的结果非常准确，证明该技术可以被用来快速分析干酪样品在制作过程中的酵母菌群落演替。2009年Mounier等[28]运用SSCP-PCR法和传统培养法对市售Livarot干酪表面的微生物群落结构进行了研究。培养法分离出细菌经过SSCP去重复后进行基因测序鉴定，同时从样品中提取的总DNA运用SSCP-PCR法进行分析。结果两种方法均表明主要的优势细菌为Microbacterium gubbeenense，Leucobacter komagatae以及Gamma变形菌纲的革兰氏阴性菌。

1.2.3 末端限制性片段长度多态性分析

末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)分析群落结构的一般步骤是：在提取样品中微生物的总DNA后，先用带有荧光标记的细菌通用性引物微生物群落的16S rRNA基因进行扩增，然后选用合适的限制性内切酶对PCR扩增产物进行切割。酶切产物最后通过测序凝胶或毛细管自动测序仪进行分离检测。该方法只能检测带有荧光标记的酶切片段，因此最后得到的结果只是PCR产物的末端。不过由于系统分类地位不同的细菌的16S rRNA基因各自的酶切识别位点不同，它们各自带有荧光的末端片段长短也不同，因此能够在测序胶中就能被分辨开。同时，荧光的强度还能反映出各微生物种群在整个群落中的分布比例。

T-RFLP是近几年来刚发展起来的一项新技术，它既可以用来鉴定菌株，也可以对比分析不同的群落结构，还可以评估特定群落中系统进化类群的细菌多样性。Liu等[29]最先使用T-RFLP方法来分析细菌群落结构，他们发现该技术可以区分一个典型的细菌群落中所有的成员，图谱与预测的完全一致。T-RFLP技术成功地区分了白蚁后肠、水体沉积物、两个不同的活性污泥等环境中的细菌群落结构，证明了该技术可以快速比较微生物群落结构的差异及分析不同生态系统中微生物的多样性。Rademaker等[30]于2005年运用T-RFLP技术分析了微生物群落结构在干酪的成熟过程中的动力学变化。该实验的研究对象为3种不同的Tilsit表面涂抹成熟干酪，在这些干酪成熟的8周当中，运用T-RFLP技术对干酪表面的微生物群落组成进行了分析。结果发现，涂抹发酵剂中的菌种存在于整个成熟过程中，而来自环境中的微生物数量多数在2～4周后达到最大，而后又迅速降低，甚至于8周后无法检测到。不过Corynebacterium属是个例外，在干酪完全成熟后仍然是其表面的优势菌。Arteau等[31]2010年运用T-RFLP法对Camembert干酪中的真菌群落结构进行了研究。分析结果表明干酪表面与内部、不同批次干酪、不同生产工艺以及不同成熟时间制得的干酪中真菌的群落结构都有所不同。研究中共检测和鉴定出了以下9种真菌：Cladosporium、Debaryomyces、Geotrichum、Kluyveromyces、Mucor、Penicillium、Pichia、Saccharomyces以及Yarrowia。

1.2.4 变性高效液相色谱技术

变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)技术采用高压闭合液相流路, 利用离子对反相液相色谱技术进行核酸片段的分离和分析。采用的离子对为三乙基胺醋酸盐缓冲溶液(TEAA)，它既是疏水的又带正电荷，既能与DNA片段分子上带负电荷的磷酸根基团反应，同时疏水基团又能与固定相C18链的疏水基团发生疏水作用力而相互吸引。TEAA由此作为“桥分子”将DNA分子片断吸附在固定相上面。当用流动相对色谱柱进行洗脱时，与固定相亲和力不同的DNA分子就能相互区分开来。DHPLC最初被设计用来临床上检测单核苷酸多肽性[32]，由于异源双链DNA分子更加容易部分解链成单链而与固定相的亲和力下降，更早的被流动相洗脱，从而达到分离的目的。

DHPLC技术在分析微生物群落结构方面有着美好的发展前景。根据Barlaan等[33]的描述，在特定变性条件和适当洗脱缓冲液的浓度梯度条件下，大小相同但碱基序列不同的DNA分子由于具有不同的解链特性，会有不同的洗脱时间，因此能够得以相互分离。DHPLC具有通量高、自动化的特点，并且洗脱出来的PCR扩增片断收集后可直接用于测序，与PCR-DG/TTGE等方法相比更加方便快捷。目前该方法已经成功用于分析海水微生物群落和监测肠道微生物菌群。此外Ercolini等[34]于2008年第一次将DHPLC技术用于分析食品相关样品中的微生物多样性。采用了DHPLC和DGGE两种方法分析了用于制作Caciocavallo Silano PDO干酪的天然乳清发酵剂(natural whey cultures，NWC)中的细菌多样性。对两种方法研究结果的比较后证明DHPLC技术在研究食品微生物群落多样性方面至少和DGGE同样有效。在此之后，Mounier等[35]2010年成功运用DHPLC技术分析鉴定了Red Smear干酪表面的酵母菌组成。

2 非培养方法的局限性和缺陷

任何分析方法都有一定的局限性，非培养方法虽然能够避免传统培养方法的不足，但其自身也有一定的缺陷。本综述所提及的大多数非培养方法都基于DNA序列分析的分子生物学技术，而分子生物学方法在分析微生物群落结构组成时的局限性在于：首先在提取干酪样品中总DNA前的样品处理过程很容易改变微生物群落的原始结构，而不同微生物在提取DNA时的裂解效率不同也会使得DNA的提取和纯化产生一定的偏差。其次，PCR技术本身也存在不足，1992年Reysenbach等[36]发现用rDNA基因在PCR过程中会产生优先扩增现象，只扩增部分细菌的D NA，造成了群落中原始成员的减少。而干酪样品成分复杂，提取DNA时所残留的杂质很可能会成为PCR扩增抑制剂，影响PCR效果[37-38]。

此外，目前用于分析干酪样品微生物群落结构的非培养方法，如PCR-DG/TTGE、SSCP-PCR、T-RFLP、DHPLC甚至是生物芯片技术都有可能造成共迁移或共洗脱现象[8-10,13-14]。不过由于允许对电泳条带或洗脱物中的PCR扩增产物进行测序，DGGE、DHPLC等技术更容易克服这种缺陷。与共迁移现象相反，DNA指纹图谱技术的另一个普遍问题在于占微生物群落1%以下的弱势种群很难被检测到，微弱的电泳条带或洗脱峰很难与背景噪音区别开来[8]。尽管如此，非培养方法已经被证明为监测干酪生产和成熟过程中微生物群落结构演替的有效手段。

3 非培养技术在干酪微生物群落分析中的应用前景

非培养技术是一门刚刚兴起的微生物群落结构分析技术，近年来受到科学家的青睐取得了令人瞩目的成就，不过这些技术仍然处于发展阶段，特别是在食品领域还处于起步阶段。无论是传统的培养法还是基于分子生物学技术的非培养法，都是试图揭示环境中微生物群落结构的一种途径。本文中提及的非培养方法都是近年来在研究干酪为生物群落结构中应用较为广泛的方法，在近年来的研究中已经展现出了巨大的优越性，成为研究干酪以及其他食品中微生物群落结构的有效工具。不过每种方法都有自身的优势和不足。为了利用各种分析方法的优势，弥补它们技术本身的缺陷，将不同分析方法结合起来进行研究近年来已经成为了一种新的趋势。例如2008年Ercolini等[34]将PCR-DGGE、DHPLC和随机扩增多态性DNA-PCR(RAPD-PCR)这3种方法结合研究了用于制作Caciocavallo Silano PDO干酪的乳清发酵剂中的微生物群落结构。2010年Arteau等[31]将T-RFLP法和自动核糖体间隔基因分析(automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA)法相结合对Camembert干酪中的真菌群落结构进行了研究。此外，克隆文库法已经被广泛地与其他方法相结合，成为干酪中微生物群落结构的有效途径。

本文提及的大部分非培养法都是基于PCR扩增的方法，必然会带有PCR扩增自身的缺陷。这些方法之间的不同组合也无法弥补PCR扩增本身带来的不足。因此基于其他原理的分析技术需要被引入以加强对环境中微生物群落真实结构的认识。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然环境中监测和鉴定不同的微生物个体，提供微生物的形态学、数量信息、空间分布、细胞环境等信息，整个分析过程对样品的介入性很小，可以弥补PCR扩增所带来的偏差。将FISH和其他分子生物学技术的结合使人们能够得到更接近真实情况的微生物群落分布信息。2009年Mounier等[28]首次对此做出了尝试，用3种方法系统地对市售的Livarot干酪表面微生物群落结构进行了研究。首先用传统培养法对市售的细菌和真菌进行了分离培养，分离所得菌株通过SSCP分析去重复后进行16S rRNA基因测序鉴定，再用SSCP-PCR分析法对从干酪样品分离的总DNA进行分析，最后FISH分析法被用来对干酪表面的微生物进行纲水平的多样性分析。FISH分析法中使用的特异性探针能够直接对干酪中的微生物进行检测，从而提供了微生物群落多样性的最直接证据。基于rRNA的分子方法与FISH分析法的结合被证实是一种研究干酪表面微生物群落的有效手段。

数10年来人们一直致力于对干酪样品以及整个生产和成熟过程中微生物群落结构的研究，从传统培养法到分子生物学技术，其目的不仅仅是获得微生物群落的分布信息，更重要的是将这些信息与微生物的功能联系起来，从而能够对干酪产品的开发和生产起到指导性作用。非培养方法虽然可以弥补传统培养方法的不足，利用不同分子生物学技术可以获得更加真实的微生物群落多样性，不过这并不意味着可以摒弃培养方法。非培养方法可以快速得到群落的整体结构情况，而要得到系统中在功能上起重要作用的菌群则需要传统培养方法。因此，单凭传统培养的方法或现代的分子生物学技术对干酪或其他生态系统进行研究，都不能很好地达到研究目的。已经有众多研究者认识到了将多种方法结合使用的重要性，本文已经多次提及这样的例子，在此不再赘述[11,20-21,28]。用分子技术指导分离培养的方向，用分离培养的结果对分子方法进行验证，二者互为补充，已经成为研究干酪以及其他食品中微生物生态学的新方向。

[1] FOX P F, GUINEE T P, COGAN T M, et al. Fundamentals of Cheese Science[M]. Gaithersburg, MD, USA: Aspen Publications, 2000.

[2] SANDINE W E, ELLIKER P R. Microbially induced flavors and fermented foods: flavor in fermented dairy products[J]. Agric Food Chem,1970, 18(4): 557-566.

[3] COPPOLA S, BLAIOTTA G, ERCOLINI D. Dairy products[M]//COCOLIN L, ERCOLINI D. Molecular techniques in the microbial ecology of fermented foods. New York, USA: Springer, 2007: 31-90.

[4] HUGENHOLTZ P, GOEBEL B M, PACE N R. Impact of cultureindependent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity[J]. Bacteriol, 1998, 180(18): 4765-4774.

[5] WARD D M, WELLER R, BATESON M M. 16S rRNA sequences reveal uncultured inhabitants of a well-studied thermal community[J].FEMS Microbiol, 1990, 75(2/3): 105-116.

[6] WARD D M, BATESON M M, WELLER R, et al. Ribosomal RNA analysis of microorganisms as they occur in nature[J]. Adv Microb Ecol,1992, 12: 219-286.

[7] HEAD I M, SAUNDERS J R, PICKUP R W. Microbial evolution,diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms[J]. Microb Ecol, 1998, 35(1): 1-21.

[8] FEURER C, VALLAEYS T, CORRIEU G, et al. Does smearing inoculum reflect the bacterial composition of the smear at the end of the ripening of a French soft, red-smear cheese?[J]. Dairy Sci, 2004, 87(10):3189-3197.

[9] DELBES C, ALI-MANDJEE L, MONTEL M C. Monitoring bacterial communities in raw milk and cheese by culture-dependent and -independent 16S rRNA gene-based analyses[J]. Appl Environ Microbiol, 2007,73: 1882-1891.

[10] El BARADEI G, DELACROIX-BUCHET A, OGIER J C. Biodiversity of bacterial ecosystems in traditional Egyptian Domiati cheese[J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(6): 1248-1255.

[11] CARRARO L, MAIFRENI M, BARTOLOMEOLI I, et al. Comparison of culture-dependent and -independent methods for bacterial community monitoring during Montasio cheese manufacturing[J]. Research in Microbiology, 2011, 162(3): 231-239.

[12] FISCHER S G, LERMAN L S. DNA fragments differing by single basepair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80(6):1579-1583.

[13] MUYZER G, WAAL E, UITTERLINDEN A. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(3): 695-700.

[14] LAFARGE, OGIER V, GIRARD J C, et al. Le potentiel de la TTGE pourletude bacterienne de quelques laits crus[J]. Le Lait, 2004, 84(1/2):169-178.

[15] OGIER J C, SON O, GRUSS A, et al. Identification of the bacterial microflora in dairy products by temporal temperature gradient gelelectrophoresis[J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(8): 3691-3701.

[16] OGIER J C, LAFARGE V, GIRARD V, et al. Molecular fingerprinting of dairy microbial ecosystems by use of temporal temperature and denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(9): 5628-5643.

[17] RANDAZZO C L, TORRIANI S, AKKERMANS A D L, at el. Diversity,dynamics, and activity of bacterial communities during production of an artisanal Sicilian cheese as evaluated by 16S rRNA analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(4): 1882-1892.

[18] RANDAZZO C L, VAUGHAN E E, CAGGIA C. Artisanal and experimental Pecorino Siciliano cheese: microbial dynamics during manufacture assessed by culturing and PCR-DGGE analyses[J]. Int J Food Microbiol, 2006, 109(1/2): 1-8.

[21] KAFILI T, RAZAVI S H, DJOMEH Z E, et al. Microbial characterization of Iranian traditional Lighvan cheese over manufacturing and ripening via culturing and PCR-DGGE analysis: identification and typing of dominant lactobacilli[J]. Eur Food Res Technol, 2009, 229(1): 83-92.

[22] ALESSANDRA V, DOLCI P, RANTSIOU K. Microbiota of the Planalto de Bolona: an artisanal cheese produced in uncommon environmental conditions in the Cape Verde Islands[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2010, 26(12): 2211-2221.

[23] HEAD I M, SAUNDERS J R, PICKUP R W. Microbial evolution,diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms[J]. Microb Ecol, 1998, 35(1): 1-21.

[24] SCHWIEGER F, TEBBE C C. A new approach to utilize PCR-singlestrand-conformation polymorphism for 16S rRNA gene-based microbial community analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(12): 4870-4876.

[25] DUTHOIT F, GODON J J, MONTEL M C. Bacterial community dynamics during production of registered designation of origin Salers cheese as evaluated by 16S rRNA gene single-strand conformation polymorphism analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(7): 3840-3848.

[26] SAUBUSSE M, MILLET L, DELBES C, et al. Application of single strand conformation polymorphism-PCR method for distinguishing cheese bacterial communities that inhibitListeria monocytogenes[J]. Int J Food Microbiol, 2007, 116: 126-135.

[27] CALLON C, DELBES C, DUTHOIT F, et al. Application of SSCPPCR fingerprinting to profile the yeast community in raw milk Salers cheeses[J]. Syst Appl Microbiol, 2006, 29(1): 172-180.

[28] MOUNIER J, MONNET C, JACQUES N, et al. Assessment of the microbial diversity at the surface of Livarot cheese using culture-dependent and independent approaches[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 133(1/2): 31-37.

[29] LIU W, MARSH T L, CHENG H, et al. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J]. Appl Environ Microbiol, 1997,63(11): 4516-4522.

[30] RADEMAKER J L W, PEINHOPF M, RIJNEN L, et al. The surface microflora dynamics of bacterial smear-ripened Tilsit cheese determined by T-RFLP DNA population fingerprint analysis[J]. Int Dairy J, 2005,15(6/9): 785-794.

[31] ARTEAUA M, LABRIEA S, ROY D. Terminal-restriction fragment length polymorphism and automated ribosomal intergenic spacer analysis profiling of fungal communities in Camembert cheese[J]. Int Dairy J,2010, 20(8): 545-554.

[32] FRUEH F W, NOYER-WEIDNER M. Use of denaturing high-performance liquid chromatography for rapid detection and identification of sevenCandidaspecies[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(12): 5912-5915.

[33] BARLAAN E A, SUGIMORI M, FURUKAWA S, et al. Profiling and monitoring of microbial populations by denaturing high-performance liquid chromatography[J]. J Microbiol Methods, 2005, 61(3): 399-412.

[34] ERCOLINI D, FRISSO G, MAURIELLO G, et al. Microbial diversity in natural whey cultures used for the production of Caciocavallo Silano PDO cheese[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 124(2): 164-170.

[35] MOUNIER J, le BLAY G, VASSEUR V, et al. Application of denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) for yeasts identification in red smear cheese surfaces[J]. Lett Appl Microbiol, 2010, 51(1): 18-23.

[36] REYSENBACH A L, GIVER L J, WICKHAM G S, et al. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction[J]. Appl Environ Microbiol, 1992, 58(10): 3417-3418.

[37] WINTZINGERODE V F, GOBEL U B, STACKEBRANDT E. Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based analysis[J]. FEMS Microbiol Rev, 1997, 21(3): 213-229.

[38] ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food[J]. J Microbiol Methods, 2004, 56(3): 297-314.

Application of Culture-independent Methods for Analyzing Microbial Communities in Cheese: A Review

MO Bei-hong，SUN Li-guo
(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Dairy Research Institute, Bright Dairy and Food Co. Ltd., Shanghai 200436, China)

The application of culture-independent methods in food industry is still in the preliminary stage. In this paper, the application of the most common culture-independent approaches for describing both bacterial and fungal communities in cheese and for monitoring microbial community in cheese manufacturing and ripening process has been reviewed. The most commonly used DNA fingerprinting techniques for investigating microbial communities in cheese are introduced, which include PCRDGGE, PCR-TTGE, SSCP-PCR, DHPLC and other techniques. Furthermore, the benefits, pitfalls and perspectives of cultureindependent methods in cheese are discussed. Based on the discussion, a polyphasic approach with the combination of culturedependent and culture-independent methods may be the best strategy to achieve more accurate structures of microbial communities.

culture-independent methods；cheese；DNA fingerprinting techniques；microbial communities

TS252.53

A

1002-6630(2012)05-0293-06

2011-04-06

上海市科委启明星项目(09QB1400200)

莫蓓红(1978—)，女，工程师，硕士研究生，主要从事乳品发酵技术与新型干酪的研究与开发。E-mail：mobeihong@brightdairy.com