TP及D2-40在肿瘤中的研究进展

张 营 刘 君

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016；2.泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

在目前很多恶性肿瘤的临床治疗中，主要是肿瘤的转移影响了恶性肿瘤治疗效果，而淋巴转移又是肿瘤较常见的转移方式，因此，通常会把淋巴转移作为判断对肿瘤分期和预后的重要因素。肿瘤转移指的是肿瘤细胞通过血管和淋巴管或体腔的途径扩散到继发部位，并在该处形成继发瘤(转移灶)的过程。在肿瘤转移的过程中，淋巴管和血管是多种实体肿瘤转移的重要途径。目前，大多数患者的肿瘤原发灶虽然可以通过手术来切除，但对于不能手术切除原发灶或者在原发灶手术后仍然有残留的患者，抗肿瘤转移的治疗十分重要，此外，对抑制那些己有转移的肿瘤细胞的进一步转移也是十分必要的[1]。因此，目前肿瘤研究的热点集中在肿瘤淋巴管和血管生成及淋巴和血管转移的机制的问题[2-3]。通过研究肿瘤转移的机制，并制定出对肿瘤转移过程的有效治疗方法十分重要。本文就胸腺嘧啶磷酸酶(thymidine phosphorylase，TP)和单克隆抗体D2-40(lymphatic monoelonal antibody， D2-40)这两种因子在肿瘤研究的进展作一综述。

1 TP

1.1 TP定位及结构特点

TP是一种从人血小板分离出的血管生长因子，又称血小板源性内皮细胞生长因子，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶由两个相同的亚单位组成，其分子量均为5500，主要用于催化胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷及其类似物的可逆的磷酸化反应，并构成碱基及2-脱氧核糖-1-磷酸。实际上，胸腺嘧啶的降解产物TP并不是直接刺激内皮细胞(EC)的分裂和增殖，但其具有酶的活性，对内皮细胞具有化学趋化性，能刺激培养的内皮细胞迁移，从而通过诱导血管新生来增加血管新生能力[4]。胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶在体内能促血管增生，在体外能够促进内皮细胞生长和具有并化学趋化性。胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶只在细胞核中表达的相对较少，一般都是在细胞浆或细胞核中表达。胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶在正常肝脏、肺等组织和细胞中有表达，并在淋巴结、外周淋巴细胞中也可以检测到胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶的活性，但对胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶的活性来说，在恶性肿瘤中的活性相对来说比在癌旁非肿瘤组织中的活性更高[1，5]。

1.2 TP的作用机制

胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶又称血小板源性内皮细胞生长因子，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶与血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用相类似，TP关系到肿瘤的血管的生成。当前，很多肿瘤的相关研究表明：胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶表达水平与肿瘤的恶性度、预后等密切相关[6-7]。实体肿瘤的生长需要在肿瘤内形成新生的血管为其提供氧和营养物质。而胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶作为核苷酸合成补救途径的一种作用酶。此酶可逆性地使胸腺嘧啶脱氧核苷分解为1-磷酸-2-脱氧核苷和胸腺嘧啶，这其中，胸腺嘧啶被代谢为二氢胸腺嘧啶，并由二氢胸腺嘧啶转化为β一氨基丁酸。在这个过程中，胸腺嘧啶通过吸引内皮细胞，并增加微血管数量，促进新生血管的形成[8]。外源性胸苷同细胞内胸苷使得细胞内5-磷酸胸苷增加，高浓度5-磷酸胸苷对微血管形成起到抑制作用[8]。在二磷酸核糖核苷酸还原酶的作用下，通过变构过程，使得其它脱氧核糖核苷酸的水平下降，造成了细胞的同步化，使其生长速度不断减缓，最终导致细胞死亡[9]。由此可见，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶与血管新生增加和程序化细胞死亡有关。胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶除了促血管增生外，同时通过血管的增生抑制剂二磷核糖核苷还原酶的水平降低，并使得胸苷转化为胸腺嘧啶，并由此使胸苷水平下降，最终解除了抑制微血管形成的作用，进一步促进血管新生和细胞的生长，增加了微血管的数目[10]。

胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶还与5-FU的药物代谢途径有关系。当前，治疗各种肿瘤广泛应用到5-FU，但5-FU的药物只能通过静脉输注不能通过口服给药，使得患者负担高额的医疗费用而且其副作用也比较大。Capecitabine作为5-FU的前体制剂可以口服，而且Capecitabine是对细胞没有毒性作用的药物，主要的药效通过体内的一系列酶将其转化为具有细胞毒性的5-FU, 胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶便是使Capecitabine能够发挥药效的一种关键限速酶。胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶能将5-DFUR转化为有活性的5-FU，并转化成5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷。口服Capecitabine治疗，Capecitabine比其他药物(5- DFUR和5-FU)优先浓集于肿瘤组织内。而且Capecitabine在肿瘤内产生的5-FU浓度是血浆和肌肉中的127倍和22倍，而使用5-FU直接治疗时，在肿瘤、血浆和肌肉中5-FU的浓度相差不大[11]。从以上研究发现，肿瘤组织中的胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶对肿瘤具有双重作用，第一，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶能协助5-FU类药物使其实现抗肿瘤的功能，第二，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶作为血小板源性内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor, PD-ECGF)，能够促进肿瘤内血管的生成。而胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶是否具有促进淋巴管生成的作用，目前还很少有报道。

1.3 TP与肿瘤

Yoshimura等[12]在1990年成功从人胎盘中提纯出胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶，并检测了胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶在人体各种组织的表达，结果发现胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶在肝脏、胃、结肠、卵巢等部位的癌组织中高于其他正常组织，而且T. B细胞淋巴瘤也高表达TP蛋白。 ShmidaH等[13]研究了153例初发食管鳞癌与72例健康对照治疗方式同胸腺嘧啶磷酸化酶水平的关系，发现TP水平相比于对照组在食管鳞癌组血清的值更高。Van[6]等发现在胃癌中胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶表达高的患者死亡率是其他TP表达阴性或低的患者死亡率的4倍。Koukouraki s等[14]对94例头颈部的鳞癌进行研究，发现胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶阳性的患者平均生存率是10个月，而TP阴性的则为36个月。Wade[15]研究发现TP在肾良性病变组织中的表达明显低于肾癌组织，表明在TP高表达水平是肾癌细胞和肾癌组织的一个特异性指标。相比于染色阴性的肿瘤，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶染色阳性的结直肠癌[16]肿瘤内微血管密度更大，细胞凋亡指数明小，与成熟的血管相比，肿瘤细胞穿透新生的血管更加容易，形成了肿瘤的浸润和转移。TP在癌组织的表达高于正常组织1.4-10倍，高于血浆20倍。癌组织TP过度表达阳性率：食管癌为57%-66.7%，结肠癌为32%-60%，子宫内膜癌为41%，卵巢癌为32%，肾癌为30.4%，非小细胞肺癌为32.6%，脑瘤为88.7%。对5种恶性肿瘤及其相应正常组织的TP 进行检测显示，胃癌、大肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌的TP阳性表达率均>60.0%，在相应的正常组织中除胃组织有16.0%程弱阳性表达外，其余均为阴性。不同病种的TP表达差异可能与肿瘤性质及生物学行为有关。所以，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶在高表达时，肿瘤内的微血管数增多，肿瘤的恶性行为更强，具体来说肿瘤分期晚、肿瘤分化差、肿瘤浸润深、肿瘤生长快、容易发生转移、肿瘤预后较差。

1.4 展望

不同的肿瘤组织对5-FU, 5-DFUR, TP抑制剂的敏感性也各不相同，因此测定肿瘤组织中的胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶活性为临床有针对性地使用5-FU类的抗肿瘤药物提供有价值的参考。对胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶阳性的肿瘤细胞高通过化疗药或胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶抑制剂来进行疗效，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶可以被许多细胞因子上调，故对胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶表达阴性的肿瘤细胞进入细胞因子以增强胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶活性及化疗疗效，是否会提高5-FU或5- DFUR等化疗药物的临床治疗效果，特别是晚期肿瘤的治疗效果是一个值得研究的课题。

2 D2-40

2.1 D2-40的分子生物学结构

D2-40是一种Ig G抗体，属于唾液酸糖粘蛋白，它分布于细胞膜，由多肽核心与糖链两部分组成。D2-40是一种抑制M2A癌胚抗原的单克隆抗体，主要作为特异的淋巴管标记物[17]。D2-40分子质量为38kD, mRNA翻译的氨基酸是一种分子质量43kD糖蛋白，D2-40由166个氨基酸构成，有单一高度保守的跨膜区域，D2-40的胞质内的C端有两个潜在的磷酸化位点，这使得胞外域随物种而变异较大，但这些胞外域都有一个相对保守的6个潜在的氧连接型糖基化位点。通过研究发现D2-40主要存在于成骨细胞膜、脉络丛上皮细胞膜、骨细胞膜、胸腺上皮细胞、肺泡I型上皮细胞膜、淋巴管内皮细胞[18]。

2.2 D2-40的分子生物学特征

D2-40在血管上无表达而只表达于淋巴管[19-20]。D2-40在正常组织的表达与淋巴管管径的大小有关，由D2-40在单层内皮构成的淋巴毛细胞的表达是最明显的，而D2-40在如胸导管。在淋巴结等有平滑肌的淋巴管表达稍差。D2-40不表达于大淋巴管和高内皮静脉，其可以表达于淋巴结门处的小淋巴管和淋巴窦内皮。D2-40表达于淋巴管内皮的选择性表现在:①D2-40抗体特异地标记于与血管特异性标志物PLA-E[21]标记的不同管道内皮上;②D2-40在超微结构确认的真皮毛细淋巴管内皮可以特异地表达;③D2-40阳性细胞也选择性地表达VEDFR-3;④在淋巴内皮来源的淋巴管瘤、水囊瘤等良陛肿瘤,D2-40表达于瘤内皮细胞。由此可见，D2-40是常用的淋巴管的标志物，对毛细淋巴管和毛细血管有很好的区分[22]。

2.3 D2-40与肿瘤

D2-40强染色在所有间皮瘤及有活性都有表达，对照组恶性间皮瘤，绝大部分细胞染色也表达了强染色，D2-40强染色为膜状且染色强，使用低倍镜下就能观察到，因此，对上皮样间皮瘤D2-40具较高的敏感性[23]。在非间皮瘤中，卵巢腺癌表达了强D2-40染色。在确定的卵巢癌中，D2-40染色都能在淋巴管上被发现[24]。D2-40表达于淋巴管内皮及淋巴管瘤，而在血管瘤，血管脂肪瘤，血管癌，脓性肉芽肿，血管畸形未见D2-40染色。此外，对卡波氏肉瘤，血管肉瘤中有D2-40表达[20，25]。由此可见，D2-40是淋巴内皮免疫反应可选择的因子。研究发现在胃和结肠癌细胞淋巴管浸润的Cajal间质细胞中D2-40也有阳性的表达。在这项研究中，进行了21胃肠道间质瘤的免疫组化研究，结果证实了D2- 40在16个胃肠道间质瘤的阳性反应。在16个肿瘤组织中，13个肿瘤组织表达阳性，其余三个肿瘤弥漫积极表达。因此，D2-40可能成为胃肠道间质瘤的标记物[26]。

Zhen LF等[27]用免疫组化方法检测了108例例浸润性乳腺导管癌和30例乳腺纤维腺瘤，分别用D2-40和CD34的标记淋巴微血管密度(LMD)和微血管密度(MD)，计算其与临床病理因素的关系进行了分析。发现LMD和MD在浸润性乳腺导管癌中明显高于乳腺纤维瘤(P<0.01)。单因素方差分析的结果也表明LMD在不同的组织学分级，淋巴转移和TNM分期中得表达不同。与肿瘤的大小、病理分级、淋巴结转移、TNM分期呈正相关关系。以上结果证实了D2- 40可以明确地标记在乳腺浸润性导管癌的淋巴管内皮细胞，并可以用来评估肿瘤的进展和转移。

2.4 展望

淋巴管生成和淋巴结转移有一定的关系，目前研究的热点问题仍然是原发肿瘤引起淋巴道转移的机制，主要有3种: 肿瘤侵袭瘤周已存在的淋巴管，肿瘤侵袭瘤内淋巴管，肿瘤细胞诱导新淋巴管生长[28-29]。当前，研究热点在于在肿瘤的淋巴道转移过程中，确定是肿瘤周围的淋巴管还是肿瘤组织中新生的淋巴管在这一过程起作用。通过研究肿瘤淋巴管生成的分子机制，能解决上述问题解决，如果肿瘤转移必须通过新生淋巴管实现，则通过抑制肿瘤淋巴管生来对肿瘤治疗，从而实现抑制肿瘤转移的措施则是可行的。单克隆抗体D2-40作为淋巴管内皮细胞的一种特异性标记，D2-40也是一种特异性最强的淋巴管内皮细胞标记物。D2-40能对正常和肿瘤组织中的淋巴管进行识别,因此进一步研究淋巴特异性内皮标记物，并由此来确定解微淋巴管的分布情况和其功能状态，这为淋巴管的生成及肿瘤转移的研究提出了新的思路。

综上所述，TP及D2-40作为淋巴管和血管的标志物，为研究肿瘤组织的转移机制提供了转机，肿瘤转移过程中，如果新生血管和淋巴管是整个过程所一定需要的，那么就针对肿瘤淋巴管和血管两方面的生成开展肿瘤治疗，达到控制肿瘤的生长及转移就会在医学界成为一项非常看好的治疗办法。

[1] Achen MCP McColl BK, Stacker SA. Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis[J]. Cancer Cell,2005, 7: 121-127.

[2] Ohta Y, ShridhaR V, Bright RK, et al. VEGF and VEGF type C play an important role in angiogenesis and lymphangiogenesis in human malignant mesothelioma tumors[J]. BrJ Cancer,1999,81(1):54-61.

[3] Wigle JT, Harvey N, Detmar M,et al. An essential role for Proxl in the induction of the lymphatic endothelial cell phenotype[J]. EMBO J,2002,21(7):1505-1513.

[4] Hotchkiss KA, Ashton AW, Klein RS, et al. Mechanisms by which tumor cells and monocytes expressing the angiogenic factor thymidine phosphorylase mediate human endothelial cell migration[J].Cancer Res, 2003, 63:527-533.

[5] J Enholm B, Jussila L,Karkkainen M, et al. Vascular endothelial growth factor-C; a growth factor for lymphatic and blood vascular endothelial cells[J]. Trends Cardiovasc Med, 1998,8(7):292-297.

[6] Van Triest B, Pinedo HM, Blaauwgeers JLG, et al. Prognostic role of thymidylate synthase, thymidine phosphorylase/platelet-derived endothelial cell growth factor, and proliferation markers in colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res,2000,6: 1063-1072.

[7] Hirano Y, Kageyama S, Ushiyamal T, et al.Thymidine phosphorylase activity in transitional cell cancer: Relation to histological parameters and chemosensitivity to fluorouracil-related drugs[J]. Anti-cancer Res,2000; 20:4315-4318.

[8] Brown NS, Bichnell R, Thymidine phosphorylase, 2-deoxy-D-ribose andangiogenesis[J]. Biochem J, 1998,334:1-8.

[9] Stevenson DP, Milligan SR, Collins WP. Effect of platelet-derived endothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase substrate and products in a three-dimensional model of angiogenesis [J]. Am J Pathol,1998,153:1641-1646.

[10] Hata K, Fujiwaki R, Maede Y, et al. Expression of thymidine phosphorylase in epithelial ovarian cancer: correlation withangiogenesis,apoptosis,and ultrasound-derived peak systolic velocity [J].Gynecol Oncol, 2000,77(1):26-34.

[11] Ishikawa T,Utoh M, Sawada N, et al. Tumor selective delivery of 5-fluorouracil by capecitabine, a new oral fluoropy-rimidine carbamate, in human cancer xenografts[J].Biochem Pharmaco1,1998,55(7):1091-1097.

[12] Petrova TV, Makinen T, Alitalo K. Signaling via vascular endothelial growth factor receptors[J]. Exp Cell Res, 1999,253(1):117-130.

[13] Shimada H, Takeda A, Shiratori T, et al. Prognostic significance of serum thymidine phosphorylase concentration in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer, 2002, 94(7): 1947-1954.

[14] Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Fountzilas G,et al. Angiogenesis, thymidine phosphorylase, and resistance of squamous cell head and neck cancer to cytotoxic and radiation therapy [J]. Clin Cancer Res,2000,6(2):381-389.

[15] Wada S, Yoshimura R, Naganuma T, et al Thymidine phosphorylase levels as a prognostic factor in renal cell carcinoma[J].BJU Int, 2003,91:105-108.

[16] Matsuura T, Karatate J, Teramach K, et al. Thymidine phosphorylase expression is associated with both increase of intrutumoral microvessels and decrease of apoptosis in human colorectal carcinomas[J].Cancer Res, 1999,59:5037-5040.

[17] Ichikura T, Tomimatsu S, Ohkura E, et al. Prognostic significance of the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and VEGF-C in gastric carcinama[J].J Surg Onco1,2001,78(2):132.

[18] Breiteneder-Geleff S, Soleiman AK owaslki H.Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillariesl Podoplanin as a specific marker for lymphatic endotheliuml[J]. Am J Pathol.,1999, 152(2): 385-394.

[19] Choi WW, Ixwis MM, Lawson D, et al. Angiogenic and lymphangiogenic microvessel density in breast carcinoma: correlation with clinicopathologic parameters and VEGF-family gene expression[J]. Mod Pathol, 2005,18:143-152.

[20] Kahn HJ, Marks A. A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of lymphatic invasion in primary tumors[J]. Lab Invest, 2002,82:1255-1257.

[21] Schlingenmann RO, Dingian GM, Emeis JJ Monoclonal antibody PAL-E specific for endothelium[J]. Lab Invest,1985,28: 235-240.

[22] Marks A, Sutherland DR, Bailey D, et al. Characterization and distribution of an oncofetal antigen (M2A antigen) expressed on testicular germ cell tumours[J]. Br J Cancer, 1999,80:569-578.

[23] Ordoiiez NG The diagnostic utility of immunohistochemistry and electron microscopy in distinguishing between peritoneal mesotheliomas and serous carcinomas: a comparative study[J]. Mod Pathol, 2005,19:417-428.

[24] Bassarova Assia V, Nesland Jahn M, Davidson Ben. D2-40 is not a specific marker for cells of mesothelial origin in serous effusions[J]. The American Journal of Surgical Pathology,2006,30,878-882.

[25] Kahn HJ, Bailey D, Marks A. Monoclonal antibody D2-40, a new marker of lymphatic endothelium, reacts with Kaposi's sarcoma and a subset of angiosarcomas[J]. Mod Pathol, 2002,15:434-440.

[26] Kuroda N, Tanida N, Oonishi K, et al. Significance of D2-40 expression in the diagnosis of gastrointestinal stromal tumor[J]. Med Mol Morphol, 2008,41(2):109-112.

[27] 甄乐锋，叶长生，刘民锋.D2-40和CD34在乳腺浸润性导管癌中的表达及其意义[J]. 南方医科大学学报，2010,30(7):1548-1551.

[28] Pepper MS, Strobe M. Lymphatic endothelium: morphological, molecular and function alproperties[J]. J Cell Bio1,2003,163:209.

[29] Stacker SA, Achen MCP JussilaL, et al. Lymphangiogenesis and cancer metastasis[J] . Nat Rev Cancer,2002,2:573.