脱氧核苷酸钠抗人肾脏细胞衰老的分子机制

郭 齐 李玉森 陈 强 霍志刚 (山东大学附属省立医院肾内科，山东 济南 25002)

肾脏缺血-再灌注时，肾小管、肾小球等相关脏器细胞均存在缺氧环境，长时间的缺氧，可能诱发肾脏细胞的衰老及凋亡，现有研究证实，衰老、凋亡的重要途径可能与JAK2-STAT的激活有关〔1〕。脏器细胞的凋亡，衰老，导致肾脏功能逐步下降，出现蛋白尿、血尿、BUN、SCr增加，最终发展为肾脏衰竭。流行病学调查〔2〕显示肾衰竭患者患病率逐渐增加，至2012年我国已有近400万肾衰竭患者，因此其已成为人类最主要的公众健康问题之一，肾衰竭患者生活质量低下，长期透析不仅增加社会或个人的医疗负担，另外其心血管并发事件及肾功能持续下降最终使得患者死亡。因此肾功能失代偿期之前的缺血、缺氧所导致的肾脏细胞的衰老、凋亡是肾病治疗中的关键一步。现已证实脱氧核苷酸具有一定的抗衰老、抗凋亡作用〔3〕，可能对肾脏细胞具有一定的保护作用。本研究采用体内、体外实验结合的方式，探究脱氧核苷酸的抗衰老、抗凋亡作用，并试图揭示脱氧核苷酸保护肾脏的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 SDS-PAGE、(Therom，美国);光学显微镜及取图系统(奥林巴斯，美国)，低温微量离心机(Eppendor公司，德国);酶标仪(岛津，日本);液氮罐及低温冰箱(Thermo公司，美国)，小型流式细胞仪10 cm(BD，美国)。IMDM 培养基(青霉素 100 U/ml，链霉素100 μg/ml)，标准胎牛血清，胰酶(美国Hyclone公司);二甲基亚矾(DMSO);兔抗人Bax多克隆抗体，鼠抗人Bcl-2单克隆抗体，辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IG，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IG，细胞凋亡检测试剂盒，免疫组化试剂盒(Sigma);STAT1及 STAT3单克隆抗体，pSTAT1及pSTAT3单克隆抗，叔丁基过氧化氢;TRITC标记二抗;内参山羊抗人β-actin多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记二抗(美国Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 体外实验 (1)MTT法〔4〕、JAK2-STAT、bcl-2/bax相关蛋白检测〔5〕:近曲肾小管上皮细胞株(HK-2)用含10% 小牛血清的IMDM培养基，37℃，5%CO2培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞生成面积为80% ～90%时，0.25%胰蛋白酶消化，PBS冲洗，调节浓度为2×105/ml，并接种于96孔平底培养板，2×104/孔。分为3组，每组4复孔，即正常对照组，脱氧核苷酸组，模型组。其中脱氧核苷酸组及模型组各孔均加入含有一定浓度CoCl2的细胞培养液，同时脱氧核苷酸组加入20 μg/ml脱氧核苷钠缺氧培育24 h，加入50 μl完全培养液和10 μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液共同孵育4 h。吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO，室温下，将96孔板置于微振器上振荡 10 min。在酶联检测仪上测波长570 nm光密度(OD)值，并计算缺氧细胞生长细胞抑制率。同时吸去细胞培养液，用4 ml预冷PBS，磷酸酶抑制剂冲洗，弃之再加入1 ml预冷PBS磷酸酶抑制剂，并转移知预冷的1 mlEppendorf管中，并准备电泳成像，主要步骤包括提取核蛋白、应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，配制SDS-PAGE凝胶的配制、电泳、转膜、免疫反应、化学发光、显影等。(2)细胞凋亡试验〔6〕:对数生长期细胞接种每孔1×106/ml接种于无菌6孔板中，2 ml/孔，培养24 h，随机分为三组，分别进行相应的干预措施，继续培养48 h、消化，制成细胞悬液，收集于 15 ml离心管，4℃预冷的 PBS冲洗 3次，1 000 r/min离心10 min，弃上清，缓冲液调节浓度为1×106/ml，取100 μl置于5 ml流式管，加入 sulFITC-AnnexinV 和 sulPl双标记，混匀温育15 min，继续加入400 μl×Binding缓冲液，采用BD小型流式细胞仪检测进行定量分析，并采用Multicyder for windows分析软件行双参数分析。

1.2.2 动物实验〔7〕30只雄性SD大鼠，随机分为三组，假手术组，脱氧核苷酸组，模型组，每组各10只。脱氧核苷酸组及模型组大鼠均采用5% 水合氯醛经腹腔注射麻醉大鼠，选取大鼠背部左侧作为手术部位，切开并暴露左肾，钝性分离肾脏包膜，于左肾的上下极各1/3切除，止血，结扎，缝合伤口，给予正常饮水、饮食。术后10 d，采用同样手术方法，结扎肾蒂，摘除右肾，脱氧核苷酸组随后每日静脉推注50 mg脱氧核苷酸钠，模型组推注生理盐水。假手术组除不切除或摘除肾外，处理方式与另外两组相似，术后推注0.9%生理盐水，于第2次手术，30 d后处死动物，处死前1 d，大鼠置于代谢笼中(禁食，不禁水)，收集24 h尿液测尿液检查尿蛋白，处死时，取血，检测血尿素氮 (BUN)、肌酐(SCr)。并取左肾组织，置于4%中性福尔马林溶液中固定，并采用石蜡包埋，制作病理切片并进行免疫组化检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0医学软件包分析，计量数值均采用±s表示，行方差分析，若方差齐性则采用t检验，若方差不齐性采用秩和检验。

2 结果

2.1 细胞生长抑制率 MTT法检测显示正常对照组无细胞生长抑制发生，模型组抑制率达到40.2% ±11.4%，脱氧核苷酸组为13.46% ±7.7%，三组间显著差异(P＜0.05)。见图1。

2.2 脱氧核苷酸对细胞凋亡的影响 图2可见，正常对照组凋亡率仅有(6.56±1.09)%，而模型组凋亡率高达(26.4±2.58)%，脱氧核苷酸干预组凋亡率为(10.8±1.44)%。三组差异显著(P＜0.05)。正常对照组Bcl-2蛋白表达的积分光密度值(IOD)为(31.97±4.29)，而脱氧核苷酸组(24.66±4.59)与模型组(14.08±2.8)表达均显著下降，模型组下降更明显(P＜0.05)。另外Bax蛋白，正常对照组表达(29.68±3.30)则显著低于模型组(109.83±14.3)及脱氧核苷酸组(44.69±6.71)，模型组增高更明显(P＜0.05)。

图2 Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达情况(×400)

2.3 脱氧核苷酸对JAK2/STAT信号通路的影响 缺氧处理后的 STAT1，P-STAT1，STAT3，P-STAT-3蛋白的表达均较正常对照组有显著地增强，细胞衰老明显增加。脱氧核苷酸组处理后，各蛋白表达均有一定程度降低，见图3。

2.4 组织病理学观察 图4、图5可见，术后取肾纵切面行HE染色，显示模型组纤维组织增生，肾小管萎缩，间质性炎症，上皮细胞呈空泡状，脱氧核苷酸组虽然有部分增生，但较为轻微。正常组则无显著改变。免疫组化检测显示模型组p-STAT1及p-STAT3蛋白表达显著增加，脱氧核苷酸组有一定程度的增加，但是增加并不明显，正常组则表达程度很低。

图3 JAK2/STAT信号通路相关蛋白表达情况

图4 肾脏的HE染色(×400)

图5 肾脏的免疫组化p-STAT1及p-STAT3表达(×400)

2.5 大鼠一般性指标 术后大鼠体重增长较慢，显著低于假手术组，脱氧核苷酸的干预有助于体重的增加。另外肾摘除术后尿蛋白，BUN，SCr水平均显著增加，脱氧核苷酸的干预有利于降低尿蛋白，BUN，SCr水平，保护肾功能，见表2。

表2 三组大鼠一般性指标比较(±s)

表2 三组大鼠一般性指标比较(±s)

组别 体重(g)尿蛋白(mg/24 h)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)446.6±14.2 6.2±2.4 6.51±0.7 37.35±6.38模型组 317.4±12.8 116.5±22.4 16.5±1.6 193.33±18.05脱氧核苷酸组假手术组366.5±23.8 42.5±21.4 12.6±1.4 121.74±10.3

3 讨论

JAK2-STAT是凋亡、衰老的重要信号通路。研究显示STAT的激活，可以激发下游途径如casepase-3蛋白的活化，bcl-2/bax蛋白表达，促进细胞发生凋亡〔8〕。另外JAK2-STAT亦是细胞衰老的重要途径，有研究显示人肾小球系膜细胞衰老过程中STAT1，STAT3均过度磷酸化〔9〕，尤其是Ang-Ⅱ的生成，可以进一步导致JAK2-STAT信号通路的活化，促进细胞的衰老，而采用Ang-Ⅱ受体抑制剂，则可以阻止STAT1，STAT3的磷酸化，细胞的衰老得到一定的控制〔10〕。脱氧核苷酸是细胞增殖和传代所需要的遗传底物，可以通过促进细胞生长，增殖从而促进损伤脏器的修复，可能有助于减少细胞的凋亡〔11〕。另外脱氧核苷酸具有稳定细胞膜的功能，通过促进细胞膜中蛋白质的合成，维持细胞的正常形态，减缓衰老所造成的细胞萎缩〔12〕。因此我们猜想脱氧核苷酸对缺血、缺氧的肾脏细胞可能有较好的保护作用。但是其抗衰老、抗凋亡的机制，我们尚不明确。本研究提示脱氧核苷酸减少了肾小管上皮细胞凋亡，促进肾小管上皮细胞的生长，采用Western印迹技术检测相关蛋白显示脱氧核苷酸促进Bcl-2蛋白的合成、抑制Bax蛋白的表达，同时阻止STAT1，STAT3磷酸化活化。因此我们基本可以判断脱氧核苷酸阻止了JAk2-STAT信号通路的表达。另外整体动物实验再次验证了我们的想法，给药9 w后5/6肾切除大鼠体重有显著改善，尿蛋白，BUN，Cr水平较模型组更低。HE染色也显示，脱氧核苷酸具有一定的细胞修复作用，可以减少大鼠肾脏的纤维化病变，空泡性病变，减少炎症。因此脱氧核苷酸对肾衰大鼠具有肾功能的保护作用。进一步采用免疫组化检测显示脱氧核苷酸减少了P-STAT1，P-STAT3表达。因此本研究为脱氧核苷酸治疗肾炎、肾功能衰竭提供了理论和实验依据。但是肾功能损伤的机制极其复杂，涉及的因素可能包括炎症、氧化应激、ECM过度沉积等，机制尚未完全阐明〔13〕，本研究，缺乏脱氧核苷酸对氧化应激、炎症因子表达的实验研究，尚不能确定其是否能清除肾衰大鼠体内的氧自由基及炎症性物质，因此在临床上脱氧核苷酸的效果尚不能估测，有待于更进一步研究。

1 Hassoun HT，Lie ML，Grigoryev DN，et al.Kidney ischemia-reperfusion injury induces caspase-dependent pulmonary apoptosis〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2009;97(1):125-37.

2 黄燕萍，王伟铭，裴道灵.上海城市社区成年人群慢性肾脏病流行病学研究〔J〕.中华肾脏病杂志，2009;12(4):33-6.

3 Rakyan VK，Down TA，Maslau S.Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains〔J〕.Genome Res，2010;20(4):434-9.

4 Sylvester PW.Optimization of the tetrazolium dye(MTT)colorimetric assay for cellular growth and Viability〔J〕.Methods Mol Biol，2011;716(1):157-68.

5 Meier C，Hoeller S，Bourgau C.Recurrent numerical aberrations of JAK2 and deregulation of the JAK2-STAT cascade in lymphomas〔J〕.Mol Pathol，2009;22(3):476-87.

6 Diaz T，Navarro A，Ferrer G，et al.Lestaurtinib inhibition of the JAK/STAT signaling pathway in Hodgkin lymphoma inhibits proliferation and induces apoptosis〔J〕.PLoS One，2011;6(4):e18856.

7 Bowmer CJ，Collis MG，Yates MS.Effect of the adenosine antagonist 8-phenyltheophylline on glycerol-induced acute renal failure in the rat〔J〕.Br J Pharmacol，1986;8(1):205-12.

8 Wen SH，Li Y，Li C，et al.Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation〔J〕.Shock，2012;38(4):411-9.

9 Neuwirt H，Eder IE，Puhr M，et al.SOCS-3 is downregulated in progressive CKD patients and regulates proliferation in human renal proximal tubulecells in a STAT1/3 independent manner〔J〕.Lab Invest，2013;93(1):123-34.

10 Kirabo A，Oh SP，Kasahara H，et al.Vascular smooth muscle Jak2 deletion prevents angiotensinⅡ-mediated neointima formation following injury in mice〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2011;50(6):1026-34.

11 Kneuertz PJ，Maithel SK，Staley CA，et al.Chemotherapy-associated liver injury:impact on surgical management of colorectal cancer liver metastases〔J〕.Ann Surg Oncol，2011;18(1):181-90.

12 何 威，周佩军，沈周俊.新型的免疫佐剂:CpG寡聚脱氧核苷酸〔J〕.中国临床医学，2008;5(13):42-6.

13 Tögel F，Hu Z，Weiss K，et al.Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2005;289(1):31-42.