生物制品生产中支原体污染的检测和预防

2012-04-13李小静练炳洲邓月嫦王凤国梁榕丽广东大华农动物保健品股份有限公司广东新兴527400

山东畜牧兽医 2012年1期

李小静练炳洲邓月嫦王凤国梁榕丽（广东大华农动物保健品股份有限公司广东新兴 527400）

生物制品生产中支原体污染的检测和预防

李小静练炳洲邓月嫦王凤国梁榕丽（广东大华农动物保健品股份有限公司广东新兴 527400）

支原体是生物制品中常见的一种污染微生物，工作环境、操作者本身、培养基、污染支原体的细胞、试验器材和用来制备细胞的原始组织或器官都可能给生产带来支原体的污染。生物制品一旦污染支原体，会引起质量下降，免疫效果得不到保证，严重时可造成人力、物力、财力上的巨大损失，因此在生物制品生产中，需严格保持无菌操作，建立快速有效的检测方法，有效防止支原体的污染。

1 支原体的特点

支原体是最小能够自我复制的原核生物，其大小介于细菌和病毒之间，结构简单，无细胞壁，形态多样，可通过细菌滤器。多数支原体适合在偏碱环境中生存，对酸性环境承受力差，对热敏感，对一般抗生素不敏感。多数支原体污染比较隐蔽，一般肉眼很难辨识，显微镜下观察，可见单个荷包样菌落。

2 支原体检测的方法

目前，支原体的检测方法很多，常用主要有分离培养法、DNA荧光染色法、电镜法、血清学方法以及核酸探针法，但在实际生产中受到诸多条件的限制，不可能全部应用于生产。培养法和PCR扩增法2种支原体的检测方法，基本适用于所有的生物制品企业，且都比较容易操作。（1）培养法是目前国内外最常用的支原体检测方法，也是目前最直接的检测方法，通过将样品接种到支原体培养基上观察液体培养基的颜色变化和固体培养基上是否长有支原体菌落来判断试验结果，准确率高，一般支原体都能检出，但此种方法培养时间长，需29d才能出最终结果。一般用于对种毒和成品的检测。（2）PCR方法是一种模拟体内DNA复制的体外扩增方法。由于支原体菌体小，对营养要求高，生长缓慢，用培养法检测一些原辅材料有一定的局限性，而PCR方法刚好弥补了这些不足，相对于培养法它快速、敏感、方便。主要用于对原辅材料(牛奶、蔗糖、细胞、培养基)和半成品的支原体检验。

2.1 培养法

1.1.1 试验材料支原体检验培养基(根据样品选择不同的培养基)，100ml玻璃瓶，培养皿，小试管(1.0×10cm)

1.1.2 试验方法（1）培养基的制备：①固体培养基的制备：固体平皿培养基是由固体培养基和辅液两部分组成。使用前将固体培养基加热至完全溶解，液体培养基置37℃水浴溶解，待固体培养基温度降到60℃左右时将辅液(60ml固体培养基+13ml辅液)沿瓶壁加入，边加边摇动，动作要轻，避免产生气泡，待二者混合均匀后按平皿规格加入适量培养基制成固体平皿培养基。②液体培养基的制备：将液体培养基无菌分装到100ml玻璃瓶，20ml/瓶，分装到小试管，1.8ml/管。（2）培养基灵敏度试验：所有用于支原体检测的培养基必须进行灵敏度试验，无论是外购培养基或是自制培养基。改良Frey氏培养基以滑液支原体CVCC2960株为质控菌株，非禽源支原体培养基以猪鼻支原体CVCC361株为质控菌株。将质控菌作10倍系列稀释至10-10，接种到液体和固体培养基，置37℃培养96h，液体培养基灵敏度达到109ccu/ml以上为合格，固体培养基灵敏度达到106ccu/ml以上为合格。

1.1.3 试验步骤（1）样品检验：病毒性活疫苗取样3~5瓶，如冻干制品则用液体培养基恢复到原量，混合后取5ml接种到小瓶培养基，再从小瓶中取混悬液0.6m1分别移植到2支小管、2个固体平皿培养基。小瓶、小管培养物放置37℃培养，平皿培养物放含5%CO2、37℃培养箱培养。每日观察培养物颜色有无变黄或变红的变化。5、10、15d分别从小瓶中取0.6ml培养物分别移植到2支小管、2个平板培养基。每次移植的小管和平皿需培养观察14d，在观察期内发现小瓶或任何1支小管颜色有变化，立即移植到小管和固体培养基，观察液体培养基是否出现恒定的pH变化及固体培养基上有无菌落出现。（2）对照：每次移植培养的同时设阴阳性对照。

1.1.4 试验结果阴性对照无支原体生长，阳性对照液体培养基变黄，固体培养基有支原体菌落生长，则检验结果有效。固体培养基无菌落生长，则判定样品无支原体污染。

2.2 PCR方法

2.2.1 试验材料 RNA/DNA抽提试剂盒，支原体PCR试剂盒

2.2.2 试验方法（1）病毒模板RNA/DNA抽提：取样品200ml按抽提试剂盒说明书进行操作，同时设立阴阳性对照，注意防止样品之间的交叉污染和样品与阳性对照的污染。（2）PCR扩增：每份总体积20ml，取16ml PCR反应液(用前混匀)，2ml Taq DNA聚合酶，2ml模板DNA，在PCR仪上按以下程序进行扩增：94℃3min，94℃30s，50℃30s，72℃45s，35循环，72℃延伸10min。（3）电泳：称1g琼脂糖于100ml50倍稀释的TAE电泳液中，微波炉中完全溶解后，加入8ml染色液混匀，在电泳槽内倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取5µl的PCR扩增产物与1µl上样缓冲液混合点样于琼脂糖凝胶孔中，并以DNA Marker DL2 000作为参照，以100V电压电泳20min后紫外凝胶成像仪拍照。（4）试验结果：阳性对照出现267bp的目的条带，阴性对照出现191bp的内控条带。被检样品也出现191bp的内控条带，则表明样品无支原体污染。

3 支原体污染的预防

支原体污染源可能存在于生产的各个细节：工作环境、操作者、培养基甚至细胞的交叉污染。这就要求生产及检验过程中严格遵循生物制品生产及检验规范，从自身做起，养成良好的工作习惯。

3.1 原材料控制

鸡胚、细胞以及生产用血清等是生物制品的重要生产原材料，自从Robinson L B等首次报道细胞培养中的支原体污染以来，国内外关于支原体污染细胞和疫苗等生物制品的报道屡见不鲜。有研究表明约20多种支原体容易污染鸡胚、细胞或血清，有的甚至出现多种支原体同时污染同一样品的现象。因此生产前保持细胞或鸡胚的纯净以及对鸡胚或细胞生产前的检验，在整个疫苗生产过程中尤为重要。

首先，保持细胞或鸡胚的纯净性。建立无支原体污染的SPF鸡群是杜绝鸡胚污染支原体最直接有效的方法。从SPF种鸡群入手，建立完善的种鸡、鸡胚支原体检验体系，有效保证生产用鸡胚的纯净性；在细胞培养方面，良好的个人卫生及操作规范是避免支原体污染的基础条件，在保证基础的同时从制度上建立完善的检验体系，从原代细胞开始，对每个代次的细胞都进行严格的支原体检验，保证任何代次的细胞都无支原体污染的潜在威胁，保证细胞系的纯净。其次，血清及培养液等是病毒培养过程中重要的营养液，同时也是支原体赖以生存的营养物质；血清和培养液本身的成分及来源都非常复杂，从源头控制支原体对血清和培养液的污染难度非常大。这就要求要针对血清及各种培养液的特性进行严格的灭菌处理，在保证无菌的同时，使用前加强对血清及培养液的检验就成为阻止支原体污染的唯一屏障。

3.2 生产及检验环节控制

GMP和ISO是一种制度，一种规范。要实现对环境的控制，有效杜绝支原体的污染仅靠规范是远远不够的，还需要工作人员的自律性及责任心。养成良好的工作习惯，严格执行各种规章制度，是避免生产及检验过程中支原体污染根基。一旦没有自律性和责任心，任何规章制度都无法实现其价值。

首先，整体生产环境消毒：车间内部进行定期的清洁，使用3%新洁尔灭定期整体环境消毒，严格保证生产环境的无菌。同时细化生产流程中原材料、半成品以及成品的运送及传输路线，严格杜绝原材料、半成品和成品之间可能出现的交叉污染；同时严格区分人员和物品的流通通道，做到人、物的分开流通，杜绝交叉污染。其次，生产设备和器械的消毒。所有的生产设备和器械必须保证无菌。在每次生产前要对所有的操作平台和生产设备进行彻底的灭菌消毒。其中操作平台要照射紫外线0.5h以上。所有的生产用具要根据其特性进行相应的高压灭菌或消毒水浸泡消毒，以确保消毒的彻底。