乳腺癌组织中Nup88、PINCH mRNA表达与HER-2的相关性研究

江建军，田延锋，赵增仁，李 芳，刘 擘，贺新奇，刘 博，张丽净

(1河北省人民医院，石家庄050031;2河北医科大学第一医院)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，据国际癌症研究机构2008年发布的报告，在全世界女性癌症患者中乳腺癌占22.9%，因乳腺癌死亡45 8503例(病死率13.7%)，严重危害女性健康。乳腺癌有多个治疗、预后指标，近10 a HER-2在标准乳腺癌治疗中已成为公认的治疗指标［1］。许多研究表明Nup88、PINCH mRNA与多种肿瘤的发生发展密切相关［2，3］，但有关 Nup88、PINCH mRNA表达与HER-2的关系的研究少见报道。本文旨在探讨乳腺癌中Nup88、PINCH mRNA的表达与HER-2的关系，以进一步了解三者在乳腺癌发生、发展及转移过程中的相互作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集河北医科大学第一医院及河北唐山工人医院2008年11月～2010年2月乳腺癌患者40例(术前均冰冻病理证实为乳腺癌)，均为女性，年龄26～75岁、平均58.5岁。病变标本离体半小时内取乳腺癌组织0.1 g，立即置入液氮罐速冻，迅速保存于－80℃冰箱，用于RT-PCR检测。

1.2 Nup88、PINCH mRNA检测方法 采用RTPCR法。取组织标本0.1 g置于无RNA酶的匀浆器中，快速加入1 mL Trizol裂解液，冰浴中匀浆，转移至离心管，每管加入氯仿200 μL，剧烈震荡3 min，静置5 min后在12 000 rpm、4℃条件下离心15 min。取上清液转移至1.5 mL Eppendorf(EP)管中，然后滴加等量的异丙醇，缓慢颠倒混匀至分层消失，并于－70℃沉淀2 h，在13 000 rpm、4℃条件下离心15 min。弃上清，沉淀物用1 mL 75%乙醇洗1次，在4℃7 500 rpm离心5 min，弃上清，置4℃冰箱，待干燥后溶于去离子水中，－80℃冰箱中备用。在紫外分光光度仪上测量260 nm(OD260)和280 nm (OD280)两个波长的吸光度(OD260/OD280大于1.8)。在1.5%琼脂糖凝胶中电泳(恒压80 V、电泳缓冲液1×TBE)30 min后，将凝胶移至紫外透射仪下进行观察，有两条完整清晰的RNA电泳条带，即28 S和18 S，且28 S的亮度和宽度是18 S的两倍，说明总RNA无降解。取2 μg RNA 37℃反转录60 min，得到cDNA。用primer5软件设计PINCH、Nup88的引物序列，以管家基因β-actin作为内参照。反应条件:94℃预变性5 min，94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃30 s，30个循环，72℃延伸10 min。将6 μL扩增产物与2 μL溴酚蓝上样缓冲液混合，在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，恒压80 V，30 min后用凝胶成像系统观察结果，在相应位置上可见清晰特异的268 bp(Nup88)的条带，置紫外灯下拍照后进行面积灰度扫描。Nup88 mRNA的相对表达量=Nup88产物吸光度值/β-actin产物吸光度值。

1.3 HER-2结果判断 HER-2蛋白过表达评估: (－)指无着色或不到10%肿瘤细胞膜着色;(+)指超过10%肿瘤细胞有微弱的或略能辨认的膜着色，仅部分细胞膜着色;(++)指超过10%肿瘤细胞可见微弱至中等的完全膜着色;(+++)指超过10%肿瘤细胞可见强而完全的膜着色。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，Nup88、PINCH mRNA表达和HER-2相关性采用Spearman相关性分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nup88、PINCH mRNA和HER2在乳腺癌组织中的表达 Nup88 mRNA在乳腺癌中的表达水平为0.575±0.230;PINCH mRNA在乳腺癌中的表达水平为0.875±0.470;HER-2蛋白表达为(－)20例，(+)8例，(++)5例，(+++)7例。

2.2 Nup88、PINCH mRNA表达与HER-2的相关性Nup88 mRNA表达与HER-2相关性无统计学意义，但具有正相关趋势，r=0.30、P=0.062;PINCH mRNA表达与HER-2相关性亦无统计学意义，但具有正相关趋势，r=0.31、P=0.054。

3 讨论

HER-2基因(又称C-erbB-2)是一种原癌基因，其在乳腺癌中表达高达20%，并且与侵袭性亚型相关［4］。HER-2阳性往往伴随着其他不良预后因素，如高TNM分期、腋窝淋巴结转移、ER和(或)PR阴性以及原发肿瘤生长迅速、分化差等［5］。HER-2基因扩增是有效预测总生存率和乳腺癌患者复发的重要因素，可影响激素、细胞毒药物和放疗的敏感性［6］。目前认为该特性与Her-2受体能激活其下游信号传导通路有关，其介导的信号转导通路主要包括以下几种:Ras-Raf-Mek-MAPK、PI3K-Akt激酶和cAMP(蛋白激酶A)等［7］。HER-2过度表达可促进细胞的有丝分裂，抑制细胞凋亡，促进肿瘤新生血管生成［8］。

核孔复合物是细胞核与细胞质之间物质与信息交换的通道［9］，在基因激活中发挥重要作用［2］，由30余种核孔蛋白组成。Nup88是一种非苯甘氨酸核孔蛋白存在于核孔复合体的细胞质面［9］。近几年研究表明，Nup88与肿瘤发生、发展密切相关。Gould等［2］应用免疫组化及免疫印迹法对214例组织(包括恶性肿瘤、良性肿瘤、异型增生组织及相应正常组织)进行分析，免疫组化结果发现，恶性肿瘤均为染色阳性，包括肉瘤、黑色素瘤、胶质瘤、淋巴肿瘤、乳腺癌、结肠癌、胃癌和前列腺癌。而Nup88与Nup214一同附着于纺锤体上参与有丝分裂，影响细胞周期［10］。HER-2亦可影响细胞有丝分裂。另外，David等［11］通过对122例乳腺癌组织的mRNA进行RT-PCR研究，发现Nup88 mRNA在乳腺癌中高表达，而Nup107则无高表达，而且在导管癌中Nup88 mRNA的表达明显高于小叶癌;组织学分级3级的患者Nup88 mRNA的表达明显高于1+2级;伴有淋巴结转移者明显强于无淋巴结转移者。表明Nup88不仅与肿瘤发生发展有关，还与肿瘤的侵袭转移相关。由此可见，在乳腺癌中Nup88与HER-2发挥类似作用。本实验研究结果显示两者在乳腺癌组织的表达有正相关趋势，提示它们在乳腺癌的发生发展及侵袭转移过程中可能有协同作用。

PINGH最初是1994年Rearden通过筛选人类cDNA文库寻找衰老红细胞抗体时发现的。PINGH基因位于染色体2q12.2，编码1个38 kDa蛋白［12］。PINCH蛋白是一种广泛表达、在进化上保守的接头蛋白，含有5个LIM结构域［13］。2002年Zhang等发现了 PINGH-2，并将之前的命名为 PINGH-1［14］。PINCH作为在肿瘤间质表达的少数蛋白中的一种，在肿瘤相关间质中的表达上调可能提示肿瘤的侵袭转移能力增强［15］。Wang-Rodriguez等［3］通过对33例乳腺癌、22例前列腺癌、5例结肠癌、6例肺癌、8例皮肤癌进行免疫组化染色发现，PINCH在上述肿瘤相关间质成纤维细胞基质中呈强阳性表达，在肿瘤浸润的边缘表达最强烈，特别是在乳腺癌组织更为显著，并且与肿瘤的侵袭和转移有关。PINGH-1可以减缓多种类型的癌细胞凋亡［16］。PINGH-1发挥生物效应的直接独立途径:一是通过与ILK的相互作用，使细胞附着［17］，同时，调节TGF-1介导的上皮向间质转化过程［18］;二是与 Ras抑制蛋白 1 (RSU-1)共同激活Rac-1，促进细胞扩散［17］。HER-2基因在乳腺癌中发挥生物效应也通过Ras基因，而且HER-2基因可促进肿瘤新生血管生成，对肿瘤的发展、侵袭、转移发挥重要作用。本研究发现PINCH与HER-2在乳腺癌中的表达具有正相关趋势。

综上所述，Nup88、PINCH mRNA表达与HER-2在乳腺癌中的表达均具有正相关趋势，可能随着样本量的增加，这种趋势会更加明显。这提示三者在乳腺癌的发生、发展及转移过程中可能发挥一定的协同作用。但它们在功能上的确切关系及相互调节的机制尚不明确，有待于进一步研究。

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