Notch1分子促进乳腺癌转移的研究进展*

王兆辉 王学春

(泰山医学院病理学教研室，山东 泰安 271000)

转移是恶性肿瘤的本质属性之一，也是患者死亡的主要原因。临床资料表明，Notch1分子与多种肿瘤的转移密切相关。在乳腺癌患者原发癌组织中，转移组和非转移组中的Notch1分子表达水平存在显著差异，并且与转移呈正相关。近些年发现，乳腺癌干细胞迁徙性增强是导致乳腺癌转移的根源。Notch1分子可能通过促进乳腺癌干细胞自我更新和增殖，以及增强乳腺癌干细胞的迁徙活性促进转移的发生。

1 Notch分子简介

Notch是一个约300 kDa的单次I型跨膜蛋白，包括胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区是与其配体结合而激活信号通路的部分，当配体与受体结合后受体暴露出TACE金属蛋白酶结合位点，在TACE金属蛋白酶作用下胞外部分发生水解，裂解片段N段部分(胞外部)被配体表达细胞内吞，C端裂解片段在γ-分泌酶的作用下发生二次水解，释放Notch受体的活化形式 (NICD/ICN)，NICD/ICN片段经过核孔进入细胞核，与DNA结合蛋白CSL/CBFI/RBP-Jκ结合，启动下游靶基因(Hes、Hey)的转录。在哺乳动物中，Notch受体可以分为四个类型：notch1～4。人的Notch配体种类有Dlll、3、4和Jaggedl、2等共五种。

Notch信号通路在胚胎发育、成体干细胞的自我更新或其沿着特定系谱方向分化等方面起着重要的调控作用。受细胞周围环境和发育环境双重作用，Notch信号通路直接决定细胞的增殖、凋亡、分化及迁移。因此，Notch信号通路对于维持机体正常发育和稳态起着十分重要的作用。

但是Notch信号通路的异常激活却与多种肿瘤的发生发展密切相关。自1991年首次在人类T淋巴母细胞白血病中发现Notch受体的异常表达外，以后又在宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、髓母细胞瘤和黑色素瘤等许多系统的肿瘤组织中发现Notch信号通路异常激活[1-4]。

2 Notch1分子在乳腺癌转移过程中的作用

最早在研究小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)感染导致乳腺癌模型时发现，MMTV逆转录DNA序列会整合到小鼠Notch4基因中，导致Notch4蛋白的异常表达[5]。后来研究者将编码Notch4胞内片段(NICD/ICN)的基因序列导入小鼠体内并使其表达，结果小鼠发生了乳腺癌，并且很快转移到肺[6]。以后的研究发现，在人类乳腺癌发展进程中，无论是乳腺原位癌还是浸润性乳腺癌都有Notch信号通路的异常激活，包括在导管内原位癌和浸润性乳腺癌都有Notch受体过表达[7]，在浸润性乳腺癌中存在高水平的Notch配体[8-9]、Notch下游靶基因(hes或hey)的转录以及Notch的抑癌基因Numb失表达[10]，提示Notch信号通路异常激活在乳腺癌发生发展中起着重要作用。而且Notch1分子与乳腺癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤等许多肿瘤转移密切相关[11-14]。在乳腺癌患者原发癌组织中，转移组和非转移组中的Notch1分子表达水平存在显著差异，并且与转移呈正相关[15]。相反，使用添加Notch信号通路阻断剂饲养移植模型鼠，或者对其所接种的乳腺癌干细胞沉默Notch1基因表达，都可以明显减少移植瘤的发生[16]。

花本林等[17]应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测60例乳腺癌组织和25例癌旁正常乳腺组织Notch1和Jag1的表达,发现人类乳腺癌中广泛存在Notch1和Jag1的高表达,而在癌旁正常乳腺组织呈现Notch1和Jag1的低表达和不表达，并且Notch1表达水平与乳腺癌转移、组织学分级、临床分期呈正相关。Reedijk M等[11]应用原位杂交技术分析了Notch相关配体受体在184例人乳腺癌组织的表达情况，发现在乳腺癌预后差的病理亚群中存在Notch1和Jag1的高表达，Notch1、Jag1的高表达患者生存期会缩短。而且如果乳腺癌组织Notch1和Jag1二者水平都较高，患者5年生存率明显下降。Farnie G等[18]发现，如果乳腺导管内原位癌组织Notch1受体细胞内片段NICD高表达，患者术后复发时间会缩短，约为术后5年。这些发现表明，Notch1是重要的促进乳腺癌转移的分子。

3 Notch1促进乳腺癌转移的相关机制

癌干细胞理论认为，在肿瘤组织中存在一类特殊细胞，移植到实验鼠体内可以增殖形成新的瘤组织，并且该瘤组织在细胞形态、组织学类型、特异性抗原的表达方面都与原发瘤完全一致。这类细胞通过自我更新和增殖，维持自身在机体中稳定存在，通过向其他不同瘤细胞亚群分化重新形成肿瘤组织[19]。 2003年，Al-Hajj等[20]首次分离出表型为CD44+/CD24-/low/ESA+的人乳腺癌干细胞，以200个的数目注射到裸鼠体内，形成了有亲代异质性的移植瘤，而非该表型细胞致瘤性却极差。以后Balic等[21]在早期乳腺癌患者骨髓中发现，一些散在的瘤细胞呈CD44+/CD24-/low表型。提示CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌干细胞还具有很强的迁徙活性。 有迁徙活性的乳腺癌干细胞无疑是导致乳腺癌转移发生的“根源”。而Notch1分子通过作用于乳腺癌干细胞，影响其存活、增殖、迁移等活性，促进乳腺癌转移的发生。

3.1Notch1分子促进乳腺癌干细胞自我更新和增殖，维持乳腺癌干细胞表型

由于已分化的细胞生活周期短，无法完成多个基因变异的积累，而干细胞具有自我更新、长期存活和相对无限增殖等特点，可以为多基因突变积累提供足够时间，因此很多学者认为，肿瘤干细胞来源于正常干细胞，并具有干细胞很多特征性属性[19-22]。Notch分子是参与调控干细胞分化的受体蛋白，正常乳腺细胞不表达或低表达，而在乳腺癌干细胞中，Notch信号相关分子呈异常高表达[7]。Notch1分子对乳腺癌干细胞的产生起着重要作用。McGowan等[16]发现，和普通未作任何处理的乳腺癌干细胞组相比，将沉默Notch1基因的乳腺癌干细胞导入小鼠体内后，移植瘤发生率明显下降。

Notch1分子促进乳腺癌干细胞自我更新和增殖，提高乳腺癌干细胞在机体内的存留时间和浓度，增加乳腺癌干细胞转移机会。Farnie G等[18]利用细胞表面标志物CD44+/CD24-/low从乳腺癌患者体内分离乳腺癌干细胞，发现Notch基因在乳腺癌干细胞呈高异常表达。他们利用无粘连微球悬浮培养技术培养乳腺癌干细胞，这些乳腺癌干细胞可以形成悬浮无粘连微球。加入γ-分泌酶抑制剂DAPT、Notch4封闭抗体能够减少微球的形成。Kondratyev M等[23]从ERBB2小鼠乳腺癌组织分离出乳腺癌干细胞，这些细胞在体外悬浮培养下形成无粘连微球，当加入γ分泌酶抑制剂MRK-003后，微球的生成减少。这些经MRK-003处理的细胞移植到同源小鼠体内不能形成移植瘤。MRK-003还可以通过诱导肿瘤细胞分化或者凋亡，可以长时间逆转乳腺癌小鼠回到正常状态。Dontu等[24]悬浮培养正常乳腺干细胞微球发现，增加激活Notch 信号的DSL 信号肽，次级微球体增加10 倍，同时激活Notch 信号还可作用于多潜能祖细胞，促进肌上皮细胞增生。而这一现象可以被Notch4封闭性抗体或者γ分泌酶抑制剂所阻断。Harrison H等[25]分别用DAPT，Notch4基因沉默，Notch1基因沉默处理单层培养的乳腺癌细胞株MCF7，与普通培养的乳腺癌细胞相比，使用DAPT培养的细胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型细胞减少约30%，Notch4沉默培养的细胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型细胞减少约50%，Notch1沉默培养的细胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型细胞减少约15%。而且激活Notch信号会提高乳腺癌干细胞对辐射耐受[26]，在使用一定剂量射线辐射无粘连悬浮培养乳腺癌微球后，NICD表达明显增加，乳腺癌干细胞比例也随之增加。

以上研究表明，Notch信号分子对于促进乳腺癌干细胞自我更新和增殖，维持癌干细胞表型有重要作用。Notch分子表达上调，促进乳腺癌干细胞的自我更新和增殖。沉默Notch基因或阻断Notch信号通路，可诱导乳腺癌干细胞分化或凋亡，逆转乳腺癌进程。李传伟等认为[27]，当乳腺干细胞经历多次致瘤性的打击以后，Notch信号通路就可能被异常激活。同时参与调控细胞增殖分化的功能随之发生紊乱，细胞分化基因失活，而增殖基因激活，导致乳腺癌的发生。如果阻断乳腺癌Notch信号通路，可以逆转乳腺癌进程，会使乳腺癌细胞重新分化或凋亡。

3.2Notch1分子增强乳腺癌干细胞迁徙活性

在肿瘤转移过程中恶性上皮细胞间黏附性降低，细胞获得足够的移动能力从原发肿瘤解离，穿过细胞外间质侵入血管，播散到远隔器官后侵出定植并导致继发肿瘤。而上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在肿瘤细胞的侵袭和远处转移中起着重要作用[28]。EMT是具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自移动的间质细胞表型的过程[29]。包括细胞黏附分子(E-cadherin)表达减少；角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架，并且引起细胞形态的改变。

Mani等[30]利用转录因子TWIST 、SNAIL及生长因子TGF-β1诱导永生化乳腺上皮细胞发生EMT，发现这些EMT细胞表达CD44+/CD24-/low，另外上皮细胞相关标志物E-cadherin表达减少，间叶组织标志物N-cadherin、纤维蛋白和波形蛋白的表达上升。Morel等[31]通过激活RAS/MAPK信号通路也成功诱导永生化乳腺上皮产生CD44+/CD24-/low表型细胞。这些CD44+/CD24-/low细胞表现出明显的E-cadherin含量减少，N-cadherin、纤维蛋白和波形蛋白的表达上升，以及FoxC2、Snail、Twist和Slug的高表达，提示有迁徙活性的CD44+/CD24-/low表型细胞可能来自EMT转化细胞。

Zavadil J等[32]发现TGF-β诱导的乳腺上皮细胞EMT需要Notch信号通路的激活实现，如果沉默HEY1或JAG1基因，或者使用Notch抑制剂都可以阻断EMT的发生。Stylianou小组[11]发现正常乳腺上皮细胞株MCF10A持续表达RBP-Jκ/VP16 或 NICD导致细胞形态发生改变，E-cadherin表达显著减少。提示Notch信号通路对乳腺癌细胞迁徙性的产生起着十分重要的作用。

在肿瘤组织中低氧刺激可以提高肿瘤细胞的转移潜能，并与肿瘤的预后不良密切相关[33-34]，低氧可以激活Notch信号通路，使上皮细胞向间质细胞表型转化，增强细胞的运动能力、增加细胞侵袭力以改变这种低氧刺激。Timmerman等[35]发现，阻断Notch信号通路可以消除低氧引起的EMT和侵袭，相反激活Notch信号通路可以取代低氧直接引起EMT。

有研究报道，在肿瘤转移过程中，癌细胞首先通过EMT而获得迁徙活性，包括对周围组织的浸润和远处器官的转移，但是当这些过程完成以后，细胞通过间质细胞上皮转型重新获得增殖能力[36]。

虽然激活Notch通路都可以增强乳腺癌细胞的迁徙活性，但是临床资料显示，Notch1分子与乳腺癌的转移的相关性更为密切。对于Notch1分子在乳腺癌转移过程中的确切机制，目前并不十分清楚，还需做大量更深入的研究。

综上所述，Notch1通过促进乳腺癌干细胞自我更新和增殖，提高乳腺癌干细胞迁徙活性，以此促进乳腺癌的转移。然而，乳腺癌转移是一个多步骤的十分复杂的过程，这些过程还要涉及癌细胞进入血道或淋巴道、瘤细胞的归巢和增殖、转移组织器官的选择等多个方面。由于没有很好的研究手段，目前对于乳腺癌转移的相关机制，仅停留在假说阶段，很多假说还未得以证实。相信随着研究技术的进步，研究方法和研究模型的改进，乳腺癌转移的更深层次机制一定可以获得澄清。在不久的将来乳腺癌转移一定能够得到有效控制，患者的生存时间、生活质量从而得到大幅提升。

[1] Nickoloff BJ,Osborne BA,Miele L. Notch signaling as a therapeutic target in cancer: a new approach to the development of cell fate modifying agents[J].Oncogene,2003,22(42):6598-6608.

[2] Radtke F, Raj K. The role of Notch in tumorigenesis: oncogene or tumour suppressor? [J].Nat Rev Cancer， 2003，39(10): 756-767.

[3] Enlund F, Behboudi A, Andren Y,et al. Altered Notch signaling resulting from expression of a WAMTP1-MAML2 gene fusion in mucoepidermoid carcinomas and benign Warthin's tumors[J].Exp Cell Res, 2004, 292(1): 21-28.

[4] Koch U, radtke F. Notch and cancer: a double-edged sword[J]. Cell Mol Life Sci，2007,64(21):2746-2762.

[5] Gallahan D, Jhappan C, Robinson G,et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis[J].Cancer Res,1996, 56(8):1775-1785.

[6] Girard L, Jolicoeur P. A full-length Notch1 allele is dispensable for transformation associated with a provirally activated truncated Notch1 allele in Moloney MuLV-infected MMTV(D)/myc transgenic mice [J].Oncogene,1998,29;16(4):517-522.

[7] Farnie G, Clarke RB, Spence K, et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways[J]. J Natl Cancer Inst, 2007,99(8):616-627.

[8] Reedijk M, Pinnaduwage D, Dickson BC, et al. JAG1 expression is associated with a basal phenotype and recurrence in lymph node-negative breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2008,111(10):439-448.

[9] Dickson BC, Mulligan AM, Zhang H, et al. High-level JAG1 mRNA and protein predict poor outcome in breast cancer[J].Mod Pathol, 2007,20(6):685-693.

[10] Stylianou S, Clarke RB, Brennan K. Aberrant activation of notch signaling in human breast cancer[J]. Cancer Res, 2006, 66(3):1517-525.

[11] Reedijk M, Odorcic S, Chang L,et al. High-level coexpression of JAG1 and NOTCH1 is observed in human breast cancer and is associated with poor overall survival[J]. Cancer Res, 2005,65(18):8530-8537.

[12] 姜昕，周建华，邓征浩,等．非小细胞肺癌中Notch1、HIF-1、VEGF蛋白及Notch1 mRNA的表达及意义[J]. 临床与实验病理学杂志,2008, 24( 3):276-279．

[13] 黄培新，王俊珊，陶春华．iNOS、MMP-2及Notch1在胃癌中的表达与转移的关系[J].同济大学学报(医学版), 2009,30(6):53-57.

[14] Zhang P, Yang Y, Zweidler-McKay PA,et al.Critical role of notch signaling in osteosarcoma invasion and metastasis[J]. Clin Cancer Res, 2008,14(10):2962-2969.

[15] 花本林， 付欣鸽， 胡文浩,等．乳腺癌和癌旁乳腺组织中Notch1 基因mRNA 及蛋白的表达 [J]. 中华病理学杂志, 2009,38(12):806-809.

[16] McGowan PM, Simedrea C, Ribot EJ,et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer[J]. Mol Cancer Res, 2011,9(7):834-844.

[17] 花本林，付欣鸽，尹亮,等.Notch1和JAG1在乳腺癌及癌旁组织的的表达比较[J].临床与实验病理学杂志,2009,25(2):127-131.

[18] Farnie G, Clarke RB. Mammary stem cells and breast cancer role of Notch signalling[J].Stem Cell Rev, 2007,3(2):169-175.

[19] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF,et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J]. Nature, 2001,414(6859):105-111.

[20] Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3983-3988.

[21] Balic M, Lin H, Young L,et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype[J]. Clin Cancer Res, 2006,12(19):5615-5621.

[22] Lobo NA, Shimono Y, Qian D,et al. The biology of cancer stem cells[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2007,23:675-699.

[23] Kondratyev M, Kreso A, Hallett RM, et al.Gamma-secretase inhibitors target tumor-initiating cells in a mouse model of ERBB2 breast cancer[J]. Oncogene, 2012,31(1):93-103.

[24] Dontu G, Jackson KW, McNicholas E, et al.Role of Notch signaling in cell-fate determination of human mammary stem/progenitor cells[J].Breast Cancer Res, 2004,6(6):R605-615.

[25] Harrison H，Farnie G，Howell SJ,et al.Regulation of breast cancer stem cell activity by signaling through the Notch4 receptor[J].Cancer Res,2010,70(2):709-718.

[26] Phillips TM, McBride WH, Pajonk F. The response of CD24(-/low)/CD44+breast cancer-initiating cells to radiation[J].J Natl Cancer Inst, 2006,98(24):1777-1785.

[27] 李传伟，李连宏，柳雅玲,等．Notchl信号在乳腺癌干细胞分化中的作用[J]．临床与实验病理学杂志,2008,24(2) 151-153.

[28] Christofori G. New signals from the invasive front[J]. Nature, 2006,441 (7092):444-450.

[29] Huber MA, Kraut N, Beug H. Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression [J].Curr Opin Cell Biol, 2005,17(5):548-558.

[30] Mani SA,Guo W,Liao MJ,et al.The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J].Cell,2008,133(4):704-715.

[31] Morel AP, Lièvre M, Thomas C,et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition[J]. PLoS One,2008,3(8): e2888.

[32] Zavadil J, Cermak L, Soto-Nieves N,et al.Integration of TGF-beta/Smad and Jagged1/Notch signalling in epithelial-to-mesenchymal transition[J]. EMBO J, 2004, 23(5):1155-1165.

[33] Schindl M, Schoppmann SF, Samonigg H,et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha is associated with an unfavorable prognosis in lymph node-positive breast cancer[J].Clin Cancer Res, 2002,8(6):1831-1837.

[34] Zhong H, De Marzo AM, Laughner E, et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha in common human cancers and their metastases[J]. Cancer Res, 1999,59(22):5830-5835.

[35] Timmerman LA, Grego-Bessa J, Raya A,et al.Notch promotes epithelia-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation[J]. Genes Dev,2004,18(1):99-115.

[36] Yang J, Mani SA, Weinberg RA.Exploring a new twist on tumor metastasis[J]. Cancer Res, 2006,66(9):4549-4552.