猪瘟和蓝耳病疫苗中BVDV和PCV污染情况调查

叶兆美

（四川铁骑力士实业有限公司冯光德实验室，四川 绵阳 621000）

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）与猪瘟病毒（CSFV）均属黄病毒科、瘟病毒属成员。猪瘟细胞苗在生产过程中要用牛血清、胰酶、牛睾丸等材料，这些材料中若带有低滴度的BVDV病原，会造成猪瘟细胞苗的污染。另外，使用含BVDV抗体的牛血清也会干扰猪瘟病毒的体外培养。更为严重的是，猪使用污染的猪瘟疫苗后可感染BVDV，出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。王新平等从我国疑似猪瘟病料中检出了BVDV。BVDV株与CSFV株的核苷酸同源性约60%，氨基酸同源性约85%，在血清学上存在交叉反应，因而血清学方法难以区分。近年来，猪瘟细胞苗质量不稳定，如滴度偏低，收次减少等，是否与细胞带有低滴度的BVDV有关。猪圆环病毒1型（PCV1）是首次作为一种PK15传代细胞的污染物被发现的，血清学调查发现PCV1普遍存在于猪体内，但是目前还没有发现一种疾病与PCV1有关。PCV2可以导致猪群发病，PCV2可以在PK15、Vero等细胞中生长，但是不出现细胞病变。PCV2感染已成为全球性猪流行病，它对全世界的养猪业造成了严重的经济损失。为什么在上世纪90年代突然暴发流行，此问题已成为世界猪病的焦点，而PCV2在细胞中可以生长但又不出现细胞病变的特点，使得有人怀疑用来培养疫苗病毒的细胞或种毒本身就受到了PCV2的污染。带着这些疑问，笔者对目前市售的猪瘟疫苗和蓝耳病活疫苗进行了BVDV和PCV2检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 市售4种猪瘟活疫苗，共计10个批次；市售4种猪蓝耳病活疫苗，共计9个批次。

1.1.2 牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒和猪圆环病毒聚合酶链反应PCR检测试剂盒，均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛病毒性腹泻病毒PCR检测方法 按应蓓蓓等（1999）介绍的方法，取冻干猪瘟活疫苗或蓝耳病活疫苗0.02g，加入裂解液，按照说明书提取RNA，进行DNA扩增，电泳。BVDV目的条带的扩增长度为341bp。

1.2.2 猪圆环病毒的PCR检测方法 按应蓓蓓等（1999）介绍的方法，取稀释备用的猪瘟活疫苗和蓝耳病活疫苗各100μL，加入裂解液，按照说明书提取RNA，进行DNA扩增，电泳。PCV2目的条带的扩增长度为1154bp，PCV1目的条带的扩增长度为652bp。

2 结果

2.1 牛病毒性腹泻病毒的PCR检测结果 用PCR方法检测的10份猪瘟活疫苗样品和9份蓝耳病活疫苗样品中，有2份样品为BVDV阳性，BVDV污染率为2/19=10.53%。其中，10份猪瘟疫苗中有1份样品为BVDV阳性，此样品为猪瘟脾淋苗；9份蓝耳病疫苗中有1份样品为BVDV阳性。

2.2 猪圆环病毒2型的PCR检测结果 用PCR方法检测的10份猪瘟活疫苗和9份蓝耳病活疫苗样品中，PCV2的污染率为2/19=10.53%。其中，10份猪瘟疫苗中有1份样品为PCV2阳性，与BVDV阳性样品为同一份样品；9份蓝耳病疫苗中有1份样品为PCV2阳性，此样品为高效细胞苗。

2.3 猪圆环病毒1型的PCR检测结果 用PCR方法检测的10份猪瘟活疫苗和9份蓝耳病活疫苗样品中，均未检出PCV1。

3 讨论与分析

3.1 目前，疫苗污染问题较严重，使用无BVDV污染并且无BVDV抗体的牛只供应的睾丸细胞，是生产猪瘟细胞疫苗的关键。中国兽药监察所2009年的检测报告显示，在23批次猪瘟牛睾丸细胞疫苗中发现有5批疫苗受牛病毒性腹泻病毒（BVDV）污染，污染率为21.74%。长期以来，临床上所用的猪瘟疫苗主要由猪瘟兔化弱毒株通过牛睾丸细胞增殖培养而成。2010年据中国农大黄凯等报道，对30个规模牛场进行BVDV抗体抽检，其阳性率高达80%以上，表明我国牛群中普遍存在BVDV感染和流行。由于牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒同属黄病毒科瘟病毒属，同源性很高，因而能互相诱导同源病毒抗体。若将已感染牛病毒性腹泻病毒或存在相应抗体的牛睾丸细胞用于疫苗制备，会由于BVDV在体外细胞培养中大多不产生细胞病变而在疫苗生产中难以检测出来，从而极易造成受污疫苗出厂。在细胞培养中，所用犊牛血清若含有牛病毒性腹泻病毒或相应抗体，则常规热灭活方法仍不能保证完全杀灭犊牛血清中的BVDV，因此同样容易导致疫苗受污染。

3.2 猪瘟抗体一直很高，为什么还会暴发猪瘟？BVDV感染妊娠母猪后可引起母猪繁殖障碍,诱发母猪流产,产死胎和弱仔；还可以通过胎盘将病毒传给胎儿，使其产下的仔猪发生先天性感染；BVDV也可引发2～4周龄的仔猪发病，临床上表现为贫血，被毛粗乱，吃料少，消瘦，生长缓慢，结膜炎、关节炎，腹泻，多数仔猪发生死亡，少数成为僵猪。剖检可见心外膜、肾脏及淋巴结有多量出血点，胃、结肠、盲肠黏膜溃疡,有多量扣状肿，与慢性猪瘟在临床症状和病理变化方面十分相似，鉴别与检测都非常困难。BVDV感染猪只后，对猪瘟疫苗的免疫有干扰作用，能抑制猪瘟抗体的产生，致使猪瘟保护性抗体水平低下，同时却产生大量的BVDV抗体，导致猪瘟免疫失败。由于现在部分厂家的猪瘟抗体检测试剂盒不能有效区分猪瘟抗体和BVDV抗体，所以就会出现明明检测出很高的猪瘟抗体，但猪群仍然会暴发猪瘟的情况。而其实检测出的抗体中，真正的猪瘟保护抗体很少，大部分可能为BVDV抗体。

3.3 北京世纪元亨公司的牛病毒性腹泻病毒PCR试剂盒不能区分是猪源BVDV还是牛源BVDV，所以本试验的检测结果也不能分辨阳性样品是猪源BVDV还是牛源BVDV；本试剂盒也不能对BVDV1和BVDV2血清型进行区别。

3.4 据报道显示，目前还未发现PCV1对猪群有致病性。PCV2感染会损害患畜的免疫器官，降低机体免疫力，导致其他疾病的继发感染；尤其是公猪感染PCV2后会通过精液传播给母猪群，导致猪群迅速感染，这是猪群中潜在的传播方式。所以使用有PCV2污染的疫苗对猪群进行免疫，将对猪群造成极其严重的危害。

[1]王新平，周绪斌.猪感染牛病毒性腹泻病毒的研究进展[J].动物医学进展，1998，19（1）：5-8.

[2]王新平，涂长春，李红卫，等.从疑似猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒[J].中国兽医学报，1996，16（4）：341-345.

[3]应蓓蓓，吴维寿.生物制品中支原体污染的快速检测[J].高技术通讯，1999，9（5）：53-56.

[4]黄凯，张俊杰，刘英霞，等.北京地区规模化牛场BVDV持续感染牛清除方案的初步实施 [J].中国动物检疫，2010，（5）：34-35.