小动物活体成像技术的应用进展

李 珂，赵 光综述，高春芳，何伟华审校

动物活体内光学成像（optical in vivo imaging）主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术在活体动物体内进行生物标记，通过成像系统来监测被标记动物体内分子及细胞等的发展进程，以及进行相关的生物、药物治疗研究[1-3]。

目前，国内、外实验动物成像的主要手段包括结构成像（解剖成像）及功能成像 （分子成像）。以optical-imaging、micro-PET、micro-SPET为代表的动物功能成像技术不但能即时反映活体动物内的细胞分布及基因表达，还能动态观察活体动物体内分子生物学过程，活体光学成像与micro-CT、MRI、ultrasound等结构成像手段结合，能为动物实验提供更客观的数据、更确切的分子生物特性。结合笔者所在医院IVIS LuminaⅡ型活体成像设备 （living image）以及Living ImageSoftware分析软件系统，对活体动物光学成像技术的应用进展综述如下。

1 标记肿瘤及抗肿瘤药物

1.1 活体肿瘤标记技术 GFP绿色荧光蛋白、β2半乳糖苷酶(LacZ)、萤火虫荧光素酶（Luc）等是目前应用较广的动物活体成像生物标记。GFP绿色荧光蛋白受蓝、紫光照射可自发地发出绿色荧光，其信号强度高，易于被捕获，且GFP不需底物，对组织、细胞均无毒副作用，故在肿瘤生长、药效评价和基因治疗等方面都得到了广泛应用。GFP的缺点在于发射波长较短，穿透力稍差，对显示深部肿瘤及微小病灶存在一定局限性。以LacZ、Luc标记的细胞较GFP更适合于深部组织肿瘤及远处转移微小病灶的研究。活体肿瘤标记途径有细胞转染原位移植术、肿瘤细胞株尾静脉注射法、致癌化学制剂腹腔注射、呼吸道吸入等。闫明霞等[4]报道的绿色荧光蛋白标记的人肺癌皮下移植瘤模型主要通过慢病毒转染法建立人肺癌NCI-H460-GFP细胞系，接种至裸小鼠体内建立皮下移植瘤模型，转染率接近100%。李艳等[5]报道的活体动物乳腺癌模型是通过脂质体包裹带有neo抗性基因及荧光素酶报告基因的真核表达质粒PGL4.17[luc2/neo]，体外转染人乳腺癌细胞株MCF-7，将获得稳定表达荧光素酶的乳腺癌细胞株（MCF-7-luc）进行皮下接种BAB-c裸鼠及尾静脉接种SCID小鼠，建立BAB-c裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠尾静脉移植瘤模型。国内目前已建立有肺癌、乳腺癌、膀胱癌标记的活体动物模型，国外文献报道还有肝癌、食管癌、胃癌等活体动物模型[6-9]。

1.2 标记抗肿瘤药物 肿瘤早期，当运用解剖成像方法尚无法检测到肿瘤病灶时，活体成像技术便可检测到肿瘤发光信号，灵敏度较高。此外，解剖成像不能区分活细胞与凋亡细胞，活体成像技术可检测到肿瘤活细胞信号，且不显示已经凋亡的肿瘤细胞信号。在抗肿瘤药物研究中，把标记过的抗肿瘤药物运用在活体动物体内，给予已接种肿瘤的小鼠以不同治疗方式、不同剂量、不同疗程的抗肿瘤药物。利用活体成像技术，在不同时间点动态观察癌细胞在活体内的生物学变化特点，观察抗肿瘤药物的最佳治疗方式、剂量、给药时间等，也可标记肿瘤细胞，间接观察阻断RNA对肿瘤细胞的识别和杀伤。

2 标记、示踪细胞

活体成像在标记、示踪细胞方面运用了生物发光和荧光两种技术。生物发光对标记少量细胞（5～300个/视野）较敏感，荧光对标记细胞数量大于300个/视野较敏感。美国文献报道的利用生物发光技术检测到细胞数量最少可至3个/视野[10]。示踪细胞指在不同时间点对细胞存活状态及分布走向进行观察，有报道可示踪的细胞包括造血干细胞、心肌干细胞、神经干细胞、CIK 细胞等[11，12]。

利用生物发光和荧光不但可以监测到活体内细胞增殖，还可监测凋亡细胞事件[13]，如荧光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式存在时无荧光素酶活性，于体内细胞不能发光，当细胞发生凋亡时，活化的caspase-3在特异识别位点切割去掉抑制蛋白，恢复荧光素酶活性就可产生发光。标记凋亡细胞可用于包括AIDS、神经退行性疾病、脊髓炎综合征、缺血/再灌注损伤及肿瘤等细胞增殖-调亡的平衡被破坏而发生的一系列相关疾病的研究。

3 标记免疫排斥

标记免疫细胞的主要特点是观察流体细胞在体内的动向和变化，常用于标记T细胞、NK细胞等，也可以标记干细胞及异体细胞，观察干细胞演化和器官移植的研究。有报道，将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨髓，可用于实时监测活体动物体内干细胞造血过程的早期事件及动力学变化[14]。观察免疫细胞对肿瘤细胞的识别、杀伤时可应用带有生物发光标记的转基因小鼠淋巴细胞，检测放化疗的效果，寻找抗肿瘤免疫治疗中复杂的细胞机制。

4 标记细菌及病毒

利用细菌荧光素酶基因可以分别标记革兰阳性和革兰阴性细菌。用标记好的细菌侵染活体动物，观测细菌在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应，再通过活体动物成像技术对已标记细菌在活体内对药物的反应进行观察，并对比实验数据进行系统研究，筛选出药物最佳剂量、给药浓度及时间，还可观察记录药物不同剂量对活体的毒副作用。其优点主要有几方面：①同一批老鼠持续观察，避免个体间差异；②有更高的灵敏度，可以在感染早期就进行活体观察；③可以有结构信息，在整体上观察活体动物的感染途径；④可定量，以比较各个器官的感染程度。在标记病毒方面，有报道用荧光素酶基因来标记HSV-1病毒，可观察到HSV-1病毒对肝脏、肺、脾及淋巴结的侵入和病毒从血液系统进入神经系统的过程[15]。

5 标记基因及转基因动物模型

活体成像技术可以从影响基因表达的各个不同的层面进行基因研究，可应用于某种疾病的基因表达、转基因动物实验以及基因治疗等。在VEGFR2-Luc转基因小鼠体内标记胚胎细胞[16，17]，在发育的过程可动态监测到小鼠体内VEGFR2发光信号逐渐降低，至小鼠出生后VEGFR2表达的发光信号消失。同样，研究者可根据研究方向，将靶基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记后转入动物体内，形成研究所需的各种小动物疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等。应用于基因治疗方面，可将一个或多个感兴趣的基因及其产物安全而有效的传递到体内靶细胞，再通过某种荧光素酶观察目的基因是否在试验动物体内持续的特异性表达或是抑制，基因治疗也是包括肿瘤等多种疾病综合治疗的一个新热点、新领域。

综上所述，LuminaⅡ活体成像仪技术优势包括：高灵敏度的CCD制冷镜头，最低温度可达-90℃到-105℃，即使体内发出很少的光子也能够检测到信号；自动曝光系统（auto exposure time）能自动检测合适的曝光时间进行成像来获得最佳信号；光谱分离技术能过滤背景荧光显示标记荧光，可直接观察活体动物体内的细胞凋亡；简易的XGI－8气体麻醉系统能使动物在成像过程中保持持续麻醉状态，保证成像质量且避免麻醉过深导致的动物死亡。相对于其他非侵入性观察手段，如Microsoft-PET、SPET，活体光学成像有灵敏度高、实验成本低廉等特点，可以在短时间内应用尽可能少的动物数精确得到预期的实验数据。

LuminaⅡ Living Image 4.0软件分析系统，能无创的定量检测小鼠原发瘤及转移瘤，并对治疗过程中肿瘤细胞的变化进行实时观测和定量评估，文献报道光学成像对于微小肿瘤转移灶 （少到100多个细胞）既可检测到发光信号，较micro-CT、MRI、ultrasound 等结构成像有更高的灵敏度[18]。 相对于传统动物实验技术，可以避免由于宰杀动物而造成的组间差异，可以节省动物的成本，可动态监测肿瘤在体内的生长和转移，使这些分子水平研究在更接近活体的环境中进行，把分子生物学体外研究方法在体内进行实现。传统肿瘤研究的方法主要局限于肉眼观察、处死动物后再进行的肿瘤体积测量、组织学切片观察等，无法动态观察整个肿瘤事件。

活体生物发光成像技术虽然是检测实验动物体内分子及细胞事件的强有力手段，但目前尚无法完成小分子药物的标记，且分辨率、体内精确定位较差。所以，活体光学成像技术与结构成像技术结合来提高分辨率、体内精确定位等将是它的发展方向，也将为疾病在分子学水平的研究提供更广阔的应用空间。

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