肢体缺血再灌注损伤机制与防治研究进展

黄瑞峰，丁 明

缺血的组织或器官恢复血供后出现一系列的并发症称为缺血再灌注（IR）损伤，包括两方面的内容：①原发病变损伤的扩大；②原发病变远处的器官和组织发生继发性的损伤。临床上缺血再灌注损伤与断肢再植的成功率密切相关。如何保存离断肢体并延长再植的时限，更好地恢复再植后的肢体功能，仍是临床上有待解决的问题。断肢缺血损伤和再植后再灌注损伤是一个连续的过程，但缺血损伤和再灌注损伤本质上是两个不同的过程，研究断肢保护是再植的基础，研究再灌注损伤是断肢保护的延续，两者不可分离。近年来对肢体缺血再灌注损伤的机制研究取得了很大成就，同时对其防治的研究也有了长足进步。现综述如下。

1 肢体缺血再灌注损伤发生的机制

Pack等[1]强调，缺血再灌注损伤发生的最根本的机制是氧自由基的大量产生和离子泵功能障碍造成细胞内钙超载以及随之而来的微血管功能障碍。IR时，Ca2+大量内流，激活钙依赖磷脂酶，降解生物膜磷脂，导致膜损害，脂质过氧化以及破坏细胞骨架并引发中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）的激活和浸润，通过呼吸爆发释放大量的氧自由基（与钙离子激活钙依赖蛋白酶，催化黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌岭氧化酶有关）、蛋白水解酶及炎症介质引发或加重细胞损伤。大量自由基的存在可氧化生物膜上的不饱和脂肪酸，使得膜流动性下降并且通透性增加，造成细胞水肿；攻击生物大分子物质，造成多种酶和核酸功能异常；对血小板和粒细胞有趋化作用，造成微循环障碍；损坏细胞器的膜结构（如溶酶体、线粒体等）；损伤DNA和线粒体，诱发细胞凋亡。在这些因素综合作用下，在微血管内PMN和内皮细胞相互粘附的作用明显增加，其结果是造成微血管功能障碍并灭活一氧化氮（NO）。研究发现核因kB（NF-κB）可高效诱导多种细胞因子 （如 TNF-a 和 IL-2、I）、IL-6、IL-8） 和黏附分子（如 ICAM-1、ECAM-1和 VCAM-1） 及趋化因子 （如 C3、COX-2）等的基因表达。NF-κB作为炎症调控的枢纽和关键，适当干预其活化具有一定的临床应用价值[2，3]。

2 肢体缺血再灌注损伤时骨骼肌细胞凋亡的基础

细胞死亡形式包括多种，已知的有坏死、凋亡和有丝分裂细胞死亡（指经过有丝分裂的死亡方式，与细胞分裂过程中受阻有关）。细胞凋亡是由基因调控的，是维持机体内环境稳态、适应内外环境的变化、维持正常生长发育生理功能的自主性死亡，是清除无功能甚至有害细胞所必须的。细胞凋亡过程是以DNA片段分化裂解为特征的耗能过程，有赖于mRNA和蛋白质的新合成。在肢体缺血再灌注损伤发生时，细胞不至于发生坏死但又恢复无望，于是选择了凋亡。缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡与氧自由基大量产生、钙超载、线粒体通透性转换孔道（mPTP）开放、NO的减少和钾通道阻滞有关[4]。哺乳动物细胞凋亡途径有二，内源性通路即线粒体途径和外源性通路即通过激活细胞膜FAS受体途径。细胞凋亡的线粒体通路被Bcl-2蛋白家族类所调控[5]。Bcl-2蛋白家族类中的凋亡前蛋白导致线粒体外膜透化释放一些细胞凋亡激活因子到细胞质中，包括细胞色素C，SMAC，核酸内切酶G，凋亡诱导因子（AIF）[6]，其中最主要的是细胞色素C，细胞色素C释放后激活一系列级联反应最终导致细胞凋亡。细胞色素C与Apaf-1在ATP/dATP存在下发生构象变化形成复合体，称为凋亡体，凋亡体吸引Caspase-9前体，Caspase-9前体聚合后被反式催化激活，活化的Caspase-9继而作用于下游的 Caspase（包括 Caspase-3，Caspase-6，Caspase-7）引起细胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族类可以在细胞凋亡期间调节线粒体功能，这个蛋白家族的凋亡前体蛋白和抗凋亡蛋白可以通过与线粒体相互作用来控制线粒体外膜的完整性[7]。基于Bcl-2的同源性结构域（BH1-4结构域），Bcl-2蛋白家族可以分为三个亚型：①抗凋亡蛋白：包括 Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1和 A1，含有BH1-4结构域；②凋亡前体蛋白：包括Bax，Bak和Bok，含有BH1-3结构域；凋亡前体蛋白Bak通常定位于线粒体外膜，Bax在受到凋亡刺激后从细胞质转移到线粒体外膜，插入外膜导致其构象变化和蛋白脂质孔成型，进而导致线粒体外膜透化；③BH3-only凋亡前体蛋白：包括Bid，Bim，Bad，Bik，Bmf，Hrk，Noxa 和 Puma，在不同细胞凋亡信号中发挥最初传感器的作用；BH3-only蛋白类被称作是直接激活子（direct activators），包括 Bid，Bim，和 Puma，既可以抑制促存活蛋白类的功能，又能直接与Bax和Bak结合导致二者构象变化从而被激活[8]。经大量实验研究发现，Bcl-2可通过抑制钙离子释放，抑制氧自由基的生成，维持线粒体膜稳定性及阻止促凋亡基因信号传导等多个方面发挥抗凋亡作用。而Bax作用与Bcl-2恰好相反，Bax蛋白可与Bcl-2蛋白结合形成异二聚体，使得Bcl-2蛋白失活而加速细胞凋亡的发生。Bcl-2与Bax的表达比值是决定细胞是否走向凋亡的关键。当Bcl-2表达增高时，与Bax形成异源二聚体使Bax失活，抑制凋亡发生；当Bax表达增高时，被磷酸化的Bcl-2与Bad相结合，这样Bax就从异源二聚体中释放出来，游离的Bax相互之间就可以形成诱导细胞死亡的同源二聚体，当这些胞质内的Bax同源二聚体易位到线粒体后就会打开线粒体内膜和外膜上的渗透转运孔（mPTP），进而导致Cytc及Apaf-1（凋亡诱导基因）释放入胞浆，启动Caspase酶系级联反应和促进蛋白质水解从而导致细胞凋亡的发生。mPTP是位于线粒体内膜的一个非特异性通道，允许<1.5 kDa的分子通过[9]。生理条件下mPTP是关闭的，在缺血再灌注损伤和细胞毒性等损伤性刺激时开放。mPTP不可逆开放废除了线粒体的跨膜电位，导致ATP生成减少。研究表明mPTP于再灌注后5～10 min开放，而不是在缺血期[10]。Baines等[11]的研究证实了mPTP开放导致细胞凋亡，在大鼠模型凋亡的心肌细胞中发现亲环素D增多。正常生理条件下，亲环素D的增多导致mPTP开放释放细胞色素C引起细胞凋亡。缺血再灌注导致mPTP开放有多种因素，其中包括：线粒体内钙超载，腺嘌呤核苷酸移位酶，与亲环素D结合以及无机磷酸盐水平。有研究证实mPTP抑制剂（环胞素A）和Cyp-D的遗传缺失可以显著减少心肌梗死发生时的梗死面积[12]。mPTP的通道部分的分子结构还没有被证明，但腺嘌呤核苷酸移位酶，亲环素D以及无机磷酸盐被认为是mPTP重要的调节成分。亲环素D结合ANT使mPTP对钙离子敏感从而促进mPTP开放，而无机磷酸盐是一种mPTP开放的抑制剂[9]。mPTP的开放可能是短暂的，可逆的，以应对那些比较弱的损伤，这并不导致ATP耗竭。但一旦发生，可能引起足量的细胞色素C释放，引起细胞凋亡。研究证明如果缺血时间较长，程度较重，造成mPTP广泛持续的开放，细胞此时仅仅依靠糖酵解供应能量，很快细胞内ATP耗尽，细胞的代谢内环境被破坏，此时细胞产生不可逆的损伤，称为细胞坏死。如果缺血时间较短或者程度较轻，再灌注后ATP能得到及时的补充从而部分或者完全恢复，细胞坏死则可能避免，但是此时mPTP仍会开放而导致细胞色素C释放，继而引起一系列反应导致细胞凋亡。

3 骨骼肌缺血再灌注损伤的防治

肢体缺血再灌注损伤不仅影响到缺血组织的成活和以后的功能恢复，而且还可能会累及远隔器官，严重者可引起多器官功能衰竭综合征而导致患者死亡。积极防治肢体缺血再灌注损伤，以防再灌注损伤扩大化，是一直以来研究的重点。现将近几年的治疗方法做简单归纳。

3.1 尽量缩短缺血时间 临床试验和动物实验观察到缺血再灌注损伤程度与缺血持续时间密切相关。下肢出血止血带时间应严格控制在2 h以内，上肢止血带时间不宜超过1.5 h，超过时限后，缺血时间越长，损伤范围越大且损伤程度越重，甚至可能进入不可逆损伤期[13]。邢新等在研究缺血再灌注损伤时对骨骼肌血管影响中证实兔肢体缺血5 h，再灌注时骨骼肌微血管内皮细胞显著肿胀，基底膜断裂，细胞间质高度水肿，最终导致大部分肌纤维坏死。因此尽快尽早的消除缺血原因，恢复血流灌注是减轻和防止缺血再灌注损伤的最基本和最重要的措施。

3.2 缺血预处理 缺血预处理指经历短暂缺血以后的组织器官可以延缓和减轻随后较长时间内的缺血再灌注所造成的损伤。这一概念自1986年由Murry首次提出后引起极大关注[14]。此后，大量实验研究从细胞、器官水平探讨预处理的保护机制，并证明缺氧预处理是一种内源性保护机制[15]。对肢体事先进行10 min缺血随后再灌注10 min，重复3次，能显著减轻随后长时间缺血所致的再灌注损伤。Lorenz等[16]发现3次预处理与1次、2次预处理相比，骨骼肌的收缩力、耐受力和肌力均有显著提高，从而提出预处理的功效依赖于预处理的次数。缺血预处理可释放多种内源性活性物质，表现为早期保护（数分钟内出血，持续2～4 h）和延迟保护（24 h出现，持续72 h）。其中蛋白激酶C（PKC）、腺苷、缓激肽、前列腺素、一氧化氮、降钙素基因相关肽等可能与早期保护有关，可能与腺苷受体激活后通过信号转导促进细胞内腺苷合成，增加能量储备及抑制粒细胞粘附等有关；延迟保护可能与热休克蛋白 70（HS70）、超氧化物歧化酶（SOD）、腺苷、一氧化氮及开发细胞膜上的通道等有关。现药物的预处理可模拟物理预处理发挥保护作用，如尼克地尔等能显著减轻骨骼肌的缺血再灌注损伤。冯亚高等[17]实验证实3-硝基丙酸预处理可显著保护骨骼肌缺血再灌注损伤。3-硝基丙酸是琥珀酸脱氢酶抑制剂，能不可逆的抑制琥珀酸脱氢酶，使得线粒体氧化磷酸化偶联受阻，ATP生成减少，以此来模拟缺血预处理。经3-硝基丙酸预处理后氧自由基生产减少，骨骼肌过氧化损伤减轻，组织中中性粒细胞聚集减轻，细胞膜稳定性加强，但其具体的保护机制尚未十分清楚。

3.3 低压低流低温再灌注 低压低流条件下实现再灌注可使恢复灌注的氧供不至于于突然增加而引发大量氧自由基的形成。缺血再灌注损伤对低温比较敏感，李靖年等[18]研究发现10～15℃低温对组织保护作用较好，低于5℃容易产生较大的生理扰乱，并对局部组织有一定程度的损伤。其保护机制可能是低温再灌注使缺血器官代谢降低、氧耗减少、氧自由基生成减少、代谢产物聚集减少；低温还可以减少白细胞粘附，降低炎症反应的发生。Thorlacious等[19]的研究表明大鼠的体表体温降至8℃，持续30 min，动脉管径明显变小，而静脉和毛细血管管径不变。低温可以显著减少血流量和功能性毛细血管的密度。

3.4 控制再灌注条件 在恢复系统血流前，调整再灌注液的组成成分和物理状态能有效减轻缺血再灌注损伤。Ihnken等[20]用动物模型模拟临床下肢血栓形成模型，在血栓的两端分别插入导管，连接于滚动泵上，并通过该泵控制血流的成分和速度，用一种复合的再灌注液与血液按1∶6的比例混合，在 37 ℃，灌注压不超过 50 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）条件下，经滚动泵将调整好的灌注液灌注30 min后恢复系统血流能明显减轻缺血再灌注损伤。再灌注液的主要成分如下：10%葡萄糖、谷氨酸和天冬氨酸作为代谢底物，别嘌呤醇可清除氧自由基，柠檬酸葡萄糖用于减轻钙超载，Thromethamine液用做pH缓冲液。Beyersdorf等[21]证明：灌注压50 mmHg，37℃，富含谷氨酸和天冬氨酸、高渗、碱性、低钙的再灌注液，在恢复血流前再灌注20 min，可使缺血肢体骨骼肌的收缩功能立即恢复。控制性再灌注在临床上已成功应用于移植和血管栓塞的治疗。

3.5 筋膜切开及部分肌肉切除术 肢体严重的缺血再灌注损伤可引起组织严重水肿，组织内压力升高，导致骨筋膜室综合征，增加了肌肉坏死感染和有毒害因子进入血液引起全身炎症反应的风险。筋膜切开可有效减轻组织内压力，同样部分功能次要肌肉的切除也可减轻组织压力，减少毒素吸收，预防全身并发症的发生。

3.6 高压氧治疗 缺血的特点是缺氧，利用高压氧增加组织对氧气的利用，以减轻缺血再灌注损伤。其机制包括：①高压氧可使血中氧张力、血氧含量和组织氧储备显著增加，迅速提高受损组织内的氧含量，并增加氧在组织中的弥散半径，从而可有效改善缺氧状态，恢复组织细胞代谢功能；②高压氧作用下，微血管和细胞膜的通透性下降，细胞内外水肿消退，微循环障碍逐步改善；③高压氧可加速侧支循环的建立和开放，为组织提供血运和营养；④高浓度氧具有抑制细菌生长的作用，尤其对厌氧菌更明显，同抗生素协同增加抗菌杀菌能力；还可增加吞噬细胞的功能；⑤高压氧作用下全身各脏器供氧充足，代谢率提高，可加速有毒物质的排泄。另外，对高压氧仓治疗有禁忌的患者还可通过高氧液来进行治疗。何小科等[22]利用高氧液对血管循环危象进行治疗，有效率达90%。高氧液含高浓度氧，其进入循环系统后立即以溶解氧（O3）方式向组织供氧，使组织细胞由无氧代谢转为有氧代谢。高氧液可提高红细胞变形能力，降低血小板凝聚力，增加纤维蛋白溶解度，能调节细胞钙离子浓度，并发挥一定的抗感染能力。

3.7 超短波治疗 吴并生等[23]将超短波用于家兔肢体缺血再灌注损伤的研究，发现超短波在及早清除氧自由基和中性粒细胞中发挥作用。其机制可能与调节机体的免疫功能，通过神经体液因素使血管扩张、血流加速，并使血氧含量、pH值等内环境发生显著变化有关。

3.8 药物治疗 药物治疗的重点包括对氧自由的清除、稳定细胞的生物膜系统、抑制钙内流和钙超载、改善微循环、减轻炎症反应等几个方面。

3.8.1 清除氧自由基及活性氧 大量实验研究证明很多药物可以发挥清除氧自由基的作用而减轻肢体缺血再灌注损伤。存在于细胞脂质的维生素A、维生素E及水溶性的维生素C、半胱氨酸、谷胱甘肽等均属低分子氧自由基清除剂。维生素C分子中第2、3位两个羟基极易释放出氢离子，具有强力的还原性，大剂量维生素C的应用可减轻创伤后氧自由基引起的损伤[24]。依达拉奉是一种新型的抗氧化剂[25]，主要通过提供电子直接清除氧自由基，并可抑制细胞膜和线粒体膜的脂质过氧化反应。另一方面，依达拉奉也不同程度地增加了线粒体SOD的活性，增强了抗氧化能力，维持了线粒体结构和功能上的完整性，保证了细胞正常氧化磷酸化，促进了ATP合成能力的恢复。过氧化物酶可以清除H2O2避免OH-的生成。超氧化物歧化酶能特异性的催化超氧自由基发生歧化反应，有效清除氧自由基，保护细胞组织免于活性氧的损害。

3.8.2 钙离子通道阻滞剂 实验证实地尔硫卓、硝苯地平、氨氯地平等钙离子通道阻滞剂既能减轻缺血性损伤，又能减轻缺血再灌注损伤[26]。其机制与钙离子通道被阻滞，钙离子内流受阻，细胞内钙超载得到控制有关。但对钙离子通道阻滞剂的研究主要集中于心肌，在肢体缺血再灌注保护中的应用较少，还有待进一步的探讨。

3.8.3 改善微循环的药物 缺血再灌注损伤发生时可出现全血粘度增高、红细胞聚集、白细胞边集、血管内微血管形成及无复流现象等微循环障碍的表现。在氧供不足情况下，血管内皮细胞进行无氧代谢，高能磷酸键持续消耗，钠钾泵功能受损，细胞内外水盐失衡，溶酶体肿胀、内质网扩张明显；氧自由基短时间爆发、脂质过氧化反应均可造成血管内皮损伤。白细胞边集造成血管机械性阻塞，多种缩血管物质和粘附分子表达增强，血小板聚集粘附能力增强，血液粘稠度增加，微血管内径缩窄，血流出现涡流等血液流变学改变，不及时处理就会发展为血栓形成、血管栓塞。传统上利用低分子右旋糖酐、肝素及阿司匹林等药物来防治缺血再灌注损伤。银杏叶的有效成分为黄酮甙和银杏内酯。蓝旭等[27，28]通过制备家兔肢体缺血再灌注损伤模型，研究发现银杏叶提取物可抑制血小板的活化，明显降低血浆TXA2的水平，抑制白细胞活化和白细胞表面CD11/CD18的表达。红花是具有通血活经、祛瘀镇痛的临床常用传统中药，经试验表明，大剂量红花注射液对ADP引起的血小板聚集有显著的抑制作用，显著降低全血粘度，影响血栓形成，表现为血栓长度缩短、形成时间延长。红花注射液在肢体缺血再灌注损伤保护方面的研究相对较少，还有待进一步探讨。

3.8.4 稳定细胞生物膜结构的药物 肌苷是三磷酸腺苷生物合成过程中的一个前体，参与次黄嘌呤补救通路、糖原酵解供给能量，使缺血肢体中三磷酸腺苷储备增加，维持细胞膜钠-钾泵的正常功能，改善细胞生物膜的通透性，维持细胞膜上较适宜的跨膜电位，从而改善组织细胞的功能，对缺血肢体起保护作用[24]。辅酶Q是磷脂酶的拮抗剂，其能通过抑制磷脂酶的活性而起稳定膜的作用[29]，辅酶Q与维生素C联合应用可减轻缺血再灌注是红细胞的脂质过氧化反应。牛磺酸是一种游离氨基酸，在骨骼肌和心肌中含量高，体内重要的内源性抗损伤物质，具有稳定细胞膜结构、防止钙离子内流，调节胞内钙稳态及清除自由基等多种细胞保护作用，从而减轻缺血再灌注损伤，它的稳膜作用机制可能与抗自由基有关[30]。地塞米松对中性粒细胞功能具有强力的抑制作用，抑制中性粒细胞活化及对血管内皮细胞的粘附和游出。这样，一方面降低了中性粒细胞的机械性阻塞，降低了微血栓形成及阻塞毛细血管和微动静脉的概率，从而减轻继发性无复流现象的发生；另一方面，抑制了中性粒细胞的活化，也就抑制了激活的中性粒细胞释放的一系列血管活性物质和炎性因子，同时抑制了中性粒细胞的“呼吸爆发”抑制了大量氧自由基的生成。大量炎性因子的释放和氧自由基的生成是缺血再灌注损伤发生的重要因素之一。Dolan等[31]研究表明，地塞米松还直接抑制中性粒细胞游出和中性粒细胞的氢过氧化物生成，阻止磷脂酶A2和花生四烯酸代谢，从而抑制生物膜脂质过氧化反应的发生，减轻中性粒细胞介导的缺血再灌注损伤。何贤清等[32]经实验证实，地塞米松能有效地维持缺血再灌注组织微循环中各级血管壁的完整性，改善微循环血流，保护内皮细胞免受损伤。

3.8.5 抗炎药物 前列环素E1可提高CAMP水平，而发挥抑制炎症介质释放、抑制白细胞对血管内皮细胞的粘附。前列环素E1还可抑制血小板聚集，扩张血管，稳定细胞膜结构。

3.8.6 其他 CO可抑制巨噬细胞和单核细胞的转移浸润，抑制TNF-α的表达，抑制血小板和白细胞的聚集和IL-18介导的炎性反应，抑制超氧化物的生成和溶酶体的释放。CO还可阻止细胞外钙离子的内流，减轻细胞钙超载，延缓缺血损伤引起的线粒体肿胀，并有血管扩张作用，对改善骨骼肌的血液循环有积极作用[33，34]。

临床上，肢体缺血再灌注性疾病日益增多，导致病残率和致死率亦日渐增高，给患者生理心理和经济等各方面带来了沉重压力。通过临床和动物实验来探讨多种方法的联合治疗，以及新方法的应用，将对肢体缺血再灌注后肢体功能的恢复和减少病残率和致死率起到积极的意义。

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