云芝糖肽聚氰基丙烯酸正丁酯纳米囊的制备工艺优选＊

吴 柱，李建明，肖海英，马 宁

(长沙医学院，湖南 长沙 410219)

云芝糖肽(polysaccharpetide，PSP)是从担子菌纲多孔菌科云芝属真菌云芝或培养的菌丝中提取的水溶性大分子多糖类，具有抗肿瘤[1－5]、抗乙型肝炎病毒[6－7]、镇痛[8]等作用。云芝糖肽对肝脏有很好的生物活性，临床上被广泛应用于治疗乙型病毒性肝炎，并作为肝癌的辅助治疗药物。但云芝糖肽干膏的引湿性强，现有制剂多为片剂、胶囊等口服制剂，存在吸收不佳、生物利用低、稳定性不强等问题。笔者拟将云芝糖肽制成载药纳米囊，并对界面聚合法制备云芝糖肽聚氰基丙烯酸正丁酯纳米囊(PSP－PBCA－NC)的工艺进行了初步优选，报道如下。

1 仪器和试药

AG285型电子天平(梅特勒－托利多上海有限公司)；Seastar星海旋转蒸发器(宁波科生仪器厂无锡市星海王生化设备有限公司)；KS－6000型超声清洗仪(宁波科生仪器厂)；纳米粒度分析仪Zetasizer 1000HSA(Malvern)；752型紫外可见分光光度计(上海光谱)；L8－80M型低温超速离心机(美国Beckman公司)。相对分子质量在7万～15万的云芝糖肽精品，由云芝糖肽粗粉提纯；氰基丙烯酸正丁酯(广州白云医用胶总公司)；泊洛沙姆188(由沈阳药科大学提供)；苯酚、硫酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、磷钨酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 纳米囊制备

将氰基丙烯酸正丁酯、乙酸乙酯溶解于丙酮，混合均匀，作为有机相；将云芝糖肽、泊洛沙姆188溶于水，混合均匀，作为水相。将有机相在磁力搅拌下以低速均匀滴加到水相中，约2 h滴加完毕，再继续磁力搅拌2 h，得含云芝糖肽的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米囊混悬液，于35℃真空旋转蒸发，除去有机溶剂并将整个体系浓缩，得均匀的不含有机溶剂的PSP－PBCA－NC混悬液。

2.2 包封率测定

本试验中，采用离心法提取后，通过紫外可见分光光度法测定包封率[9－10]。精密量取PSP－PBCA－NC混悬液1mL，低温超速(4℃，18 000 r/min)离心1 h，取下层沉淀，用1mL甲醇溶解，超声30min，低温超速离心20min，取上层清液，在490 nm波长处测定，得纳米囊内总糖量(W1)。另精密量取PSP－PBCA－NC混悬液0.2mL，以甲醇0.8mL溶解，超声30min，低温超速离心20min，取上层清液，在490 nm波长处测定，得混悬液中总糖量(W2)。采用苯酚硫酸法反应，在490 nm波长处测定云芝糖肽总糖量[2005年版《中国药典(二部)》附录ⅣA]。包封率(%)=(W1/ 5W2)×100%。

2.3 正交试验

按单因素试验初选的制备条件和工艺，以包封率为考察指标，选取药物与氨基丙烯酸正丁酯用量比(因素A)、乙酸乙酯与氨基丙烯酸正丁酯用量比(因素B)、油水两相比(因素C)、转速(因素D)为主要影响因素，各因素分别取3个水平，按正交试验表L9(34)设计各因素水平，对PSP－PBCA－NC的制备工艺进行优化。因素水平表见表1，正交试验方差分析见表2。可见，4个因素对结果的影响均显著，最佳处方工艺组合为A1B3C1D3。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验方差分析结果

2.4 处方工艺参数与验证试验

正交试验确定的最佳处方工艺为A1B3C1D3，即氰基丙烯酸正丁酯用量为0.1 mL，药物用量为20 mg，乙酸乙酯用量为2 mL，油水两相比为1∶1，转速为18 000 r/min。根据最佳处方工艺制备3批PSP－PBCA－NC样品，测定平均包封率，结果为83.7%。

2.5 粒径测定

取适量PSP－PBCA－NC样品，稀释后用激光粒度分析仪进行扫描，粒径度分布见图1。结果平均粒径为268.5 nm，粒径分布范围为203.7～312.6 nm。

图1 PSP－PBCA－NA粒径分布图

2.6 扫描电镜观察

将PSP－PBCA－NC用1.5%磷钨酸染色，以扫描电镜观察其形态，结果见图2。可见PSP－PBCA－NC为球形实体，表面有一层薄薄的聚氰基丙烯酸正丁酯膜。

3 讨论

3.1 溶剂对纳米囊粒径分布的影响

试验中筛选出非质子性溶剂丙酮作为有机溶剂。若选用质子性溶剂如乙醇，制得的云芝糖肽纳米囊出现两种粒径分布，这是由于质子性溶剂的阴离子XO－与水的OH－分别作为聚合反应的引发剂，从而造成粒径分布不均。

图2 PSP－PBCA－NA扫描电镜图

3.2 表面活性剂对纳米囊粒径分布的影响

单因素筛选试验中，曾选择吐温80作为表面活性剂，结果纳米囊容易聚集，导致粒径变大。吐温80能降低纳米囊表面张力，使纳米囊聚集，粒径变大。

3.3 有机溶剂含量对纳米囊粒径分布的影响

采用界面聚合法制备的PBCA－NC体系中含有有机溶剂，需通过浓缩将其除去，同时以提高纳米囊在悬浮液中的含量。经试验，室温条件下纳米囊稳定，且浓缩后粒径分布更趋均匀。这是由于有机溶剂丙酮具极好的水溶性，能向水相均匀扩散，可使制成的包囊结构不紧密，粒径较大。

[1]OoiVE，Liu F.Immunomodulation and anti－cancer activity of polysaccharide－protein complexes[J].Curr Med Chen，2000，7(7)：715－729.

[2]Ng TB.A review of research on the protein－bound polysaccharide

(polysaccharopeptide，PSP) from the mushroom Coriolus Versicolor (Basidiomycetes：Polyporaceae)[J].Gen Pharmac，1998，39(1)：1－4.

[3]Wasser SP.Medicinal mushroom as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides[J].Microbiol Biotechnol，2002，60(3)：258－274.

[4]Iguchi C，Nio Y.Plant polysaccharide PSK：cytostatic effects ongrowth and invasion；modulating effect on the expression of HLA and adhesion molecules on humangastric and Colonic Tumor cell surface[J].Anticancer Res，2001，21(21)：1 007－1 013.

[5]曾淑君，沈宝莲，文良珍，等.复方云芝糖肽对裸鼠人鼻咽癌抗癌作用研究[J].中药药理与临床，1994，10(5)：35－36.

[6]宋子贤，梁世文，伍学泉，等.云芝糖肽胶囊治疗慢性乙型肝炎临床观察[J].广西医学，2000，22(6)：424－425.

[7]符孔舟，王清江，杨海平.云芝菌胶囊联合双嘧达莫片治疗儿童慢性乙型肝炎的疗效分析[J].时珍国医国药，2005，16(8)：804－805.

[8]殷伟平，龚 珊，蒋红星，等.云芝糖肽的镇痛作用及其机理的初步分析[J].中成药，2002，24(1)：41－43.

[9]张 强，廖工铁.硫酸庆大霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微球制备工艺研究[J].中国药学杂志，1996，31(1)：24－27.

[10]刘月新，谭牛仔，田育望，等.吡喹酮聚乳酸纳米粒制备工艺研究[J].中南药学，2008，6(6)：641－644.