云芝糖肽抗烟草花叶病毒活性及云芝液态发酵条件的优化

王 燕，米伟丽，吴 宽

(1.杨凌职业技术学院 生物工程分院，陕西杨凌 712100;2.西安理工大学，西安 710048；3.旱区作物逆境生物学国家重点实验室/西北农林科技大学 植保学院，陕西杨凌 712100)

病毒病是仅次于真菌病的第二大作物病害。由于作物病毒病在生产上易传播蔓延，每年都给世界作物造成巨大损失。中国是一个农业大国，病毒病严重损害水稻、小麦、玉米、马铃薯、苹果、猕猴桃、甜瓜、番茄等农作物，因此，有必要研究与开发新型抗病毒药物，以采用绿色防控，挽回产量损失。

云芝(Coriolusversicolor)在中国资源丰富[1]。采用多种方法，从云芝菌中提取云芝糖肽，是云芝细菌中的重要活性成分之一，具有提高人体免疫力和抵抗乙肝病毒和乳腺癌疾病的功能[2-7]。Zhao等[8]发现喷施云芝糖肽能增加植物体内水杨酸的含量，上调富含亮氨酸的抗病蛋白基因表达量，抵抗烟草花叶病毒(TMV)的感染。在前人抗病毒活性和发酵技术研究的基础上，本研究优化云芝发酵条件，测定PSP对烟草花叶病毒的钝化、预防与治疗作用，为工业化大批量连续性发酵生产云芝糖肽提供技术条件，期望研发成为一种新的微生物源抗病毒剂[9-12]与广谱免疫剂[13]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵菌株(杂色云芝菌)采集于秦岭森林腐木上。烟草花叶病毒(TMV)、三生烟(Nicotianatobacumvar.‘Samsun’)和心叶烟(N.glutinosa)由西北农林科技大学植保学院提供。烟草花叶病毒保存在防虫纱网内三生烟苗上。病毒必克药剂购买自杨凌农药经销店。PDA液态发酵培养基组成：葡萄糖20 g、蔗糖10 g、酵母提取物 2 g、蛋白胨2 g、K2HPO42 g、KH2PO41.5 g、MgSO41.5 g，加入蒸馏水1 L。

1.2 方法

1.2.1 毒力测定 将云芝糖肽发酵干粉分别配成不同浓度的药液(10、20、40、60、80、100 mg/L)，选用三生烟3～4叶期幼苗，给叶片均匀摩擦接种TMV，每株接种两个叶片，7 d后喷施云芝糖肽稀释液，每个处理38株，21 d后调查发病株数，参照文献[14]的方法计算药剂的相对防治率和云芝糖肽发酵干粉的EC50。

1.2.2 云芝糖肽预防、治疗和钝化作用的测定 采用半叶枯斑法测定云芝糖肽对TMV的预防、治疗和钝化效果。预防作用测定方法：用云芝糖肽水溶液喷施心叶烟左半叶，12 h或24 h后在右半叶接种TMV。治疗作用测定方法：在右半叶接种TMV，12 h或24 h后在左半叶喷施云芝糖肽水溶液。钝化作用测定方法：分别取100 mL云芝糖肽水溶液与100 mL TMV接种液等量混合，分别在1、2和3 h后取混合液，将混合物喷施在心叶烟左半叶，在右半叶接种TMV。每个处理5株，每株处理3个叶片，重复3次，14 d后调查心叶烟枯斑数。对照药剂病毒必克药剂稀释500倍使用。参照文献[15]的方法计算药剂的相对抑制率。

1.2.3 培养基成分 碳源筛选：在PDA液体培养基上，只改变碳源，分别加入30 g/L葡萄糖、蔗糖、赤砂糖、淀粉、复合碳源葡萄糖和蔗糖进行发酵。氮源选择：碳源确定后，分别加入酵母提取物与蛋白胨等改变氮源，灭菌后发酵培养。添加植物油：在筛选碳源和氮源后，培养基中添加1%花生油进行发酵，所有处理重复3次，测定云芝的生物量和云芝糖肽的产量。

1.2.4 培养条件 接种量优化：将接种液分别按照发酵液总体积的10%、12%、14%、16%、20%加入发酵瓶，进行发酵；培养基pH优化：将pH调为3、4、5、6、6.5、7进行发酵；转速优化：将转速调为160、180、200、220 r/min进行发酵；温度优化：温度分为24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃进行发酵。所有处理在100 mL/250 mL三角瓶中培养7 d，重复培养3次，测定云芝的生物量和有效成分产量。

1.2.5 正交试验设计 根据在发酵培养基的单因素试验结果，选择赤砂糖(20,30,40 g/L)，酵母提取物(2,3,4 g/L)，蛋白胨(1,2,3 g/L)，磷酸二氢钾(1,1.5,2 g/L)4因素3水平(序列号1,2,3)。试验采用4因素3水平L9(34)正交设计。

2 结果与分析

2.1 云芝糖肽对TMV的毒力

三生烟叶片接种TMV后，第7天分别喷施10、20、40、60、80、100 mg/L不同浓度的云芝糖肽稀释液，21 d后调查发现发酵产物云芝糖肽表现出对TMV有明显的抗病毒活性，其毒力回归方程为y=2.38+1.51x,有效抑制中浓度EC50=54.54 mg/L，相关系数r=0.986 3。

2.2 云芝糖肽预防、治疗和钝化作用

将云芝糖肽稀释液与烟草花叶病毒接种液等量混合，分别处理1 h、2 h、3 h，接种心叶烟叶片，半叶法试验结果表明80 mg/L云芝糖肽对烟草花叶病毒的钝化作用效果显著，芝糖肽稀释液对烟草花叶病毒活性的钝化率依次为45.71%、 62.86%和68.57%(表1)。

表1 云芝糖肽稀释液对烟草花叶病毒的钝化活性Table 1 Inactivation effect of PSP on TMV

用云芝糖肽稀释液对TMV侵染进行预防试验，结果表明，云芝糖肽浓度对TMV侵染有明显预防活性， 当喷施80 mg/L浓度稀释液 12 h和24 h的处理效果分别为54.05%和 64.86%，优于对照药剂效果(表2)。

表2 云芝糖肽稀释液对烟草花叶病毒的预防活性Table 2 Prevention effect of PSP on TMV

用云芝糖肽稀释液对TMV侵染进行治疗试验，结果表明，在心叶烟被接种TMV后12 h和24 h，分别喷施80 mg/L云芝糖肽稀释液，治疗效果分别为54.55%和51.11%(表3)。

表3 云芝糖肽稀释液对烟草花叶病毒的治疗活性Table 3 Therapy effect of PSP on TMV

2.3 发酵基质成分对云芝糖肽产量的影响

碳源筛选试验结果表明，赤砂糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉可以作为云芝秦岭菌株生长的碳源，赤砂糖效果最好，云芝糖肽产物最多，每升发酵液为0.81 g(图1)。

1.葡萄糖+蔗糖;2.葡萄糖;3.蔗糖;4.淀粉1.Glucose+sucrose;2.Glucose;3.Sucrose;4.Starch图1 碳源对发酵产量的影响Fig.1 Effect of carbon source on fermentation yield

氮源筛选试验结果表明，分别添加酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏和大豆蛋白胨，云芝秦岭菌株生长快速，但当加入酵母提取物与蛋白胨作为时，生物量和云芝糖肽量最高，每升发酵液中提取的生物量为9.48 g，云芝糖肽为1.48 g。

试验结果表明，将1%的花生油添加到优化的发酵培养基中，生物量增加5.95%，云芝糖肽的产量增加34.46%(图2)。

1.酵母提取物+蛋白胨;2.酵母提取物;3.蛋白胨;4.胰蛋白胨;5.牛肉膏;6.大豆蛋白胨1.Yeast extract+peptone;2.Yeast extract;3.Peptone; 4.Tryptone;5.Beef extract;6.Soy peptone图2 氮源对发酵产量的影响Fig.2 Effect of nitrogen source on fermentation yield

2.4 培养因素对云芝糖肽产量的影响

发酵温度优化试验结果表明，随着发酵温度的升高，云芝发酵液中生物量和云芝糖肽均呈现先上升再下降。发酵温度为28 ℃时生物量和云芝糖肽产量最高，每升发酵液分别为9.38 g和 1.44 g(图3)。

图3 温度对发酵产物的影响Fig.3 Effect of temperature on fermentation yield

酸碱度对发酵产物影响试验结果表明，随着初始pH的上升，云芝液态发酵的生物量和云芝糖肽均呈现先上升再下降的趋势，当发酵液pH为自然pH 6.5，生物量为最高，达到9.58 g/L，云芝糖肽的产量为最高，每升发酵液提取1.37 g (图4)。

图4 pH对发酵产物影响Fig.4 Effect of pH on fermentation yield

发酵瓶转速对发酵产物影响试验结果表明，随着发酵速度的加快，云芝发酵的生物量和云芝糖肽产量呈现出先增加后减少的趋势。当发酵瓶转速为200 r/min，每升发酵液中生物量和云芝糖肽产量达最高，分别为8.87 g和1.47 g。菌种接种量试验结果表明：随着接种量的增加，云芝液体发酵的生物量呈上升趋势，但产量逐渐下降。接种量为10%时，云芝糖肽最高产量为每升发酵液提取1.76 g。

多因素正交试验结果表明，每升培养基中赤砂糖40 g、酵母提取物3 g、蛋白胨1 g和磷酸二氢钾2 g时，活性产物云芝糖肽产量最高，达到每升发酵液中云芝糖肽为1.45 g。比较所有因素对生物量和云芝糖肽二者的影响因素，结果表明所有因素对生物量和云芝糖肽的影响基本相同，说明生物量和云芝糖肽产量存在正相关。

3 讨 论

临床观察发现云芝糖肽表现出调节免疫和抗病毒等多种功能，目前作为医药广泛使用[4-6]。云芝糖肽是从云芝液态发酵菌丝体中提取出来的蛋白多糖[7-10]。本研究发现云芝胞内糖肽对TMV有显著的钝化、预防和治疗作用，说明云芝糖肽在植物病毒病防治上具有重要的应用价值。通过对分离得到的秦岭杂色云芝菌液态发酵，获得云芝糖肽液态发酵基质与发酵优化条件，确定的最优发酵培养基成分为：赤砂糖40 g/L、酵母提取物3 g/L、蛋白胨2 g/L、K2HPO42 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO41.5 g/L、花生植物油1%。最佳发酵条件为初始pH6.5、接种量10%、温度27 ℃、转速200 r/min，液体发酵培养7 d，可以获得高表达的云芝糖肽，取得云芝糖肽发酵生产条件，有助于产业化研究[13-16]。

目前，通过液体发酵获得云芝糖肽是最常用方法。尽管云芝糖肽的液态发酵国内外已有一些研究，但不同的培养基和发酵条件严重影响云芝糖肽的发酵产量。本研究所用菌株是通过实验室鉴定和筛选获得的优良菌株。在单因素筛选基础上，进一步正交试验优化发酵培养基和发酵条件，最后取得重要的发酵技术参数。