DNA甲基转移酶在肝细胞癌中的表达及其临床意义

沈苑

论著

DNA甲基转移酶在肝细胞癌中的表达及其临床意义

沈苑

目的：探讨DNA甲基转移酶1（DNMT1）、DNA甲基转移酶3a（DNMT3a）和甲基转移酶3b（DNMT3b）在肝细胞癌（HCC）中的表达及其意义。方法：应用免疫组化检测47例HCC癌组织、42例HCC癌旁肝组织及12例正常肝组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达情况，分析三者与临床病理特征之间的关系。结果：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在HCC中阳性表达分别为80.9%、68.1%和78.7%，在癌旁组织内的表达分别为50.0%、52.4%和57.1%，均明显高于正常肝组织内的阳性表达（16.7%、16.7%和25.0%），且DNMT1、DNMT3a和DNMT3b与HCC的病理分化类型及乙肝表面抗原阳性显著相关（P＜0.05）。结论：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的异常表达与HCC的发生发展有紧密的关系。

DNA甲基转移酶；肝细胞癌；临床病理特征；相关性

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生受多个肿瘤相关基因的调控，如癌基因的激活和抑癌基因的失活，而抑癌基因启动子区域CpG岛的异常高甲基化在HCC的形成中起重要作用[1]。抑癌基因启动子的高甲基化又与DNA甲基化酶（DNA methyltransferase，DNMT）的高表达或活性增强密切相关。目前发现DNMT家族成员包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b 4个成员[2]。DNMT1和DNMT3b是DNA甲基化的关键酶，其表达直接影响着DNA甲基化状态[3]。本研究旨在观察DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在HCC组织、癌旁组织及正常肝组织中的表达，并探讨其临床病理学意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集湖州市中心医院2008年3月—2011年10月收治的HCC患者的临床和病理资料。本组共47例，男36例，女11例；年龄33～65岁，平均（45±8）岁。病理特点，高分化9例，中分化17例，低分化21例。表面抗原阳性41例，阴性6例。术前均未经过放化疗，无饮酒史，取HCC组织及其癌旁组织，其中癌旁组织共收集到42例，表面抗原阳性37例，阴性5例，以同期行肝血管瘤手术的12例患者的瘤旁肝组织标本作为对照（男8例，女4例，表面抗原阳性2例，阴性10例）。组织标本使用甲醛固定，石蜡包埋。

1.2 试剂 鼠抗人DNMT1单克隆抗体（工作浓度1∶100）、兔抗人DNMT3a多克隆抗体（工作浓度1∶200）、鼠抗人DNMT3b单克隆抗体（工作浓度1∶100）均购于美国Santa Cruz公司，EnVision二步法免疫组化检测试剂盒，DAB显色试剂盒为DAKO公司产品。

1.3 免疫组织化学法 应用免疫组化En Vision二步法，操作按照试剂盒说明书。每例标本均用PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照。

1.4 结果判定 DNMT1和DNMT3b为核阳性染色，DNMT3a呈弥漫或局灶性的胞浆阳性染色。阳性染色为棕黄色。采用双盲法观察并计数。每张切片予400倍视野下随机选取5个视野进行观察。阳性细胞比例：无阳性细胞为0分，阳性细胞数＜25%为1分，阳性细胞数25%～50%为2分，阳性细胞数50%～75%为3分，阳性细胞数＞75%为4分；取5个视野阳性细胞比例的平均值，＜2分为阴性；≥2分为阳性。1.5 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表达组间差异及三者表达与临床病理特性的关系采用χ2检验，三者指标之间的关系用Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达 DNMT1和DNMT3b为核阳性染色，DNMT3a呈弥漫或局灶性的胞浆阳性染色。阳性染色为棕黄色，见图1～图3。DNMT1在HCC癌细胞中、癌旁细胞中和正常肝细胞中的阳性表达率分别为80.9%、50.0%、16.7%，癌、癌旁组织及正常肝组织表达之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。DNMT3a在HCC癌细胞中、癌旁细胞中和正常肝细胞中的阳性表达率分别为68.1%、52.4%、16.7%，癌组织与癌旁组织之间的表达无差异（P＞0.05），而癌组织、癌旁组织分别与正常肝组织之间的表达的差异有统计学意义（P＜0.05）。DNMT3b在HCC癌细胞中、癌旁细胞中和正常肝细胞中的阳性表达率分别为78.7%、57.1%、25.0%，癌、癌旁组织及正常肝组织表达之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

图1 DNMT1在HCC表达阳性（SP ×400）

图2DNMT3a在HCC表达阳性（SP ×400）

图3DNMT3b在HCC表达阳性（SP× 400）

表1DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在不同组织中的表达

2.2 HCC组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表达与临床病理特性的关系 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表达与病理分化类型、乙肝表面抗原阳性显著相关（P＜0.05），与年龄、性别和吸烟史无关，见表2。其中乙肝表面抗原阴性HCC癌组织中有2例表达，而在其癌旁组织及正常组织中均未表达。

2.3 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在HCC组织中表达的相关性 DNMT1与DNMT3a表达值的相关系数为（χ2=6.1868，r=0.8675，P＜0.05），提示两者明显相关，DNMT1与DNMT3b表达值的相关系数为（χ2=2.2172，r=0.2134,P＞0.05），提示两者无明显相关。DNMT3a与DNMT3b表达值的相关系数为（χ2=0.8042，r=0.1917,P＞0.05），提示两者无明显相关。

表2DNMT1、DNMT3a和DNMT3b与HCC临床病理特性的关系

3 讨论

近年来，越来越多的证据表明表观遗传学改变在肿瘤进展中扮演十分重要的角色，而DNA甲基化是表观遗传调控的重要机制之一，参与靶基因转录表达的调控以及对基因转录后的调控，在肿瘤细胞分化和增殖中发挥重要的效应。目前发现，在几乎所有的人类肿瘤中都存在基因CpG岛的过甲基化的现象[4-5]。在肝细胞肝癌的发生和发展过程中，基因的甲基化同样发挥着重要的作用。例如，抑癌基因p16、RASSF1A、APC、SFRP1和RUNX3等被发现在肝细胞肝癌中存在高甲基化的状态[6]。而肿瘤中基因高甲基化的发生机制目前还未被人们完全了解，而体内基因甲基化的过程主要是有甲基化转移酶完成的。

DNA甲基化转移酶DNMT1,DNMT3a和DNMT3b是DNA甲基化的关键酶，与DNA甲基化活性密切相关。DNMT1定位与染色体19p13.2，其功能主要是在细胞的分裂过程中维持DNA新生链的甲基化状态与形式，维持甲基化转移酶的功能。DNMT3a定位于人染色体2p33，DNMT3b定位于人染色体20q11.2，两者的功能主要是催化DNA甲基化新生位点，在配子形成和植入后的胚胎中起建立新甲基化模式，形成甲基化转移酶的作用[7]。但目前DNMT在肝细胞肝癌组织中的研究还较少。

本研究结果显示，HCC组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白的表达值显著高于癌旁组织和正常肝组织，且差异有统计学意义，提示在HCC组织中存在着DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的过度表达，并且可能是肝细胞肝癌中相关基因高甲基化的重要因素。本研究还发现HCC癌旁组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白的表达值显著高于正常肝组织，且差异有统计学意义，我们认为可能与癌旁组织在许多方面是具有肿瘤细胞特征的癌前期变化，是在致癌因素作用下所出现的病变，因此进一步表明了DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在HCC的发生发展中可能起重要作用。同时，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表达与肿瘤的组织分化程度明显相关，说明它们可能在HCC的发展进程中发挥重要作用，可能是将来肝细胞肝癌的潜在治疗靶点。本研究中，DNMT1与DNMT3a的表达存在着明显的相关性，提示这两种基因在HCC中的异常表达的机制可能是相同的。而DNMT3b与前两种的表达无明显相关性，提示在HCC中，它与前两种基因的异常表达可能存在不同的机制，但它可能与DNMT1、DNMT3a共同作用促进抑癌基因的甲基化。结果还表明，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的高表达与肿瘤患者的HBsAg的阳性明显相关，而在HBsAg阴性的癌旁组织及正常组织中均未表达，说明乙肝病毒感染可能是引起DNMTs的高表达或活性增强的重要因素，并且在HCC癌前病变过程中可能就开始发挥重要作用。

综上所述，DNMT1,DNMT3a和DNMT3b的异常表达在HCC的发病过程发挥着重要作用，在其作用下可能导致HCC的某些抑癌基因启动子区异常甲基化，失去对肿瘤发生的抑制作用。其具体机制还有待于在今后的实验中进一步证实。本研究为今后进一步研究DNMTs家族的作用及具体机制提供了理论基础。

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[3]Ting AH,Jair KW,Suzuki H,et al.Mammalian DNA methyltrans⁃ferase 1:inspiration for new directions[J].Cell Cycle,2004,3(8): 1024-1026.

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（收稿：2012-04-20 修回：2012-08-12）

（责任编辑 屈振亮）

Expression and clinical significance of DNA methyltransferases in Hepatocellular Carcinoma

SHEN

Yuan Huzhou Central Hospital，Zhejiang Huzhou，(313000),China

Objective To investigate the expression and significance of DNA methyltransferase 1（DNMT1）, 3a(DNMT3a)and 3b（DNMT3b)in human hepatocellular carcinoma(HCC). Methods The expression of DN⁃MT1,DNMT3a and DNMT3b was detected in 47 cases of HCC tumor specimen and 42 cases of HCC paracarci⁃noma liver tissue by immunohistochemistry，12 cases of normal liver tissue as control;the results and clinical pathological parameters were analyzed. Results The positive expression rate of DNMT1,DNMT3a and DN⁃MT3b in HCC tissues was 80.9%、68.1%and 78.7%respectively.The positive expression rate of DNMT1,DN⁃MT3a and DNMT3b in paracarcinoma tissues was 50.0%、52.4%and 57.1%respectively.All of them are signifi⁃cantly higher than that in normal liver tissues（16.7%、16.7%和25.0%）.The expression of DNMT1,DNMT3a and DNMT3b was correlated with tumor differentiationand and hepatitis B surface antigen(HBsAg)(P＜0.05). Conclusion DNMT1,DNMT3a and DNMT3b maybe play important roles on carcinogenesis and the develop⁃ment of HCC.

DNA methyltransferases；hepatocellular carcinoma；clinical significance；relevance

R735.7

A

1007-6948(2012)05-0435-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.05.001

浙江省湖州市中心医院外科（湖州 313000）

沈 苑，E-mail：hzshenyuan@126.com