荠菜多糖提取液的除蛋白工艺研究

欧 文，黄榕彬，曹 轩，贺冬秀，陈临溪，唐国涛

（南华大学药物药理研究所，湖南 衡阳 421001）

荠菜（Capsella bursa-pastoris）为十字花科1~2年生草木植物，全草可入药，是药食同源植物。荠菜多糖是荠菜中的主要活性成分之一。近年来，多糖所具有的各种生理功能逐渐为人们所重视，如降低血糖浓度、抗肿瘤、抗疲劳及抗衰老等。从天然动植物提取的多糖，往往含有大量蛋白质，蛋白质的存在不仅可能影响其结构和生物活性，且可能导致药理作用下降[1~2]，因此，脱蛋白是一个重要的环节。常见的脱蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法等[3]，不同的除蛋白方法适用于不同来源的多糖，目前尚未见到去除荠菜多糖中蛋白质方法的研究报道。本试验通过对以上3种方法的比较，对荠菜多糖提取液中最佳的蛋白质去除方法进行了初步探讨，以清洁、条件温和、操作简单的方法为多糖类药品和保健产品的开发提供了有利条件[4].。

1 材料与仪器

荠菜采摘于湖南省衡阳市新华开发区，经过南华大学严奉祥教授鉴定。荠菜阴干，粉碎，过0.42mm筛，备用。

日本岛津UV-2450紫外分析仪、BSZZ4S型电子分析天平、80-1型离心机。

木瓜蛋白酶、考马斯蓝G-250（Roche）、牛血清白蛋白。葡萄糖、三氯乙酸、三氯甲烷、苯酚、正丁醇、浓硫酸等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 多糖提取方法

称取荠菜药材粉末60g，加4倍量95%乙醇回流提取脱脂，药渣加600mL蒸馏水超声1h，过滤，离心，取上清液，得粗多糖提取液。

2.2 多糖含量测定方法

采用苯酚-硫酸法，准确称取葡萄糖20.0mg，置烧杯中，加水溶解转至100mL容量瓶并稀释至刻度作为母液，吸取 0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL葡萄糖母液置不同的具塞试管中用蒸馏水补充至2.0mL，加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，摇匀冷却，室温放置20min，490nm测吸光度，以2.0mL蒸馏水按同样操作为空白对照，以葡萄糖质量浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标Y，进行回归处理，建立回归标准曲线方程为Y=1.183X-0.003（r=0.9994）。表明葡萄糖质量浓度在1.0~6.0mg·mL-1的范围内，X与Y的线性关系良好。

2.3 蛋白含量测定方法

蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[5]。取6支具 塞 试 管，分 别 加 入 0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL配置好的标准牛血清白蛋白溶液（100g·L-1），用蒸馏水加至0.6mL，摇匀后各加入考马斯亮蓝G-250溶液5mL（100mg考马斯亮蓝G-250与50mL 95%的乙醇混合，再加入100mL 85%的磷酸溶液定容至1000mL），放置5min，在595nm波长下测定。以牛血清白蛋白含量为横坐标X，吸光度为纵坐标Y，进行回归处理，建立回归标准曲线方程Y=1.2457X+0.1020（r=0.996）。表明牛血清白蛋白含量在16.7~100mg·mL-1的范围内，X与Y的线性关系良好。

2. 4 蛋白去除方法比较研究

2. 4. 1 指标的确定

采用蛋白去除率和多糖损失率作为指标进行考察。

2.4.2 Sevag法

取50mL多糖提取液，按照多糖提取液、氯仿、正丁醇的体积比为16∶4∶1加入氯仿与正丁醇，混合物离心振荡30min，分出上清液，多次重复上述步骤测定上清液的多 糖和蛋白浓度。多次测量蛋白去除率均不足80%（图1），而此时多糖的损失率在20%。

图1 Sevag法

2.4.3 三氯乙酸法

依次取10mL多糖提取液加入5支具塞试管，再分别加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL三氯乙酸溶液（3 mol·L-1），4℃下静置过夜，离心弃去沉淀，收集上清液，测定多糖和蛋白浓度。测定蛋白去除率85.52 %（图2），多糖损失率为25.08 %。

2.4.4 木瓜蛋白酶法

配置木瓜蛋白酶溶液：取1g木瓜蛋白酶，用pH 5.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液溶解，定容至100mL，酶液最终质量浓度为10g·L-1。另取10 mL多糖提取液，加入2.0%的木瓜蛋白酶溶液，在50℃水浴酶解1.5h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，3000r·min-1离心5min除去沉淀，取上清液醇沉，沉淀复溶至原体积，测定溶液中多糖和蛋白浓度。测定蛋白去除率88.21%，多糖损失率为7.43%。

图2 三氯乙酸法

比较Sevag法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法脱除蛋白的效果，发现木瓜蛋白酶法除蛋白的去除率最高，多糖损失率最小，因此选择木瓜蛋白酶法除蛋白进行优化实验，考察不同因素对蛋白去除率的影响。

2.5 蛋白去除率的影响因素优化

2.5.1 酶用量对蛋白去除率的影响

取10mL荠菜多糖提取液，在反应温度60℃，pH 5.0的反应体系中，分别加入酶用量为1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的木瓜蛋白酶溶液，水解2h，测定酶用量对蛋白去除率的影响。当酶用量2.0%时，蛋白去除率为89.01%（图3），继续增加酶用量，蛋白去除效果增加不明显，故酶用量选择2.0%。

图3 酶用量对蛋白去除率影响

2.5.2 pH对蛋白去除率的影响

温度60℃，酶用量2.0%，调节pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，酶解 2h 后，测定蛋白的去除率（图4），当pH为5.0时，蛋白去除率最高。

2.5.3 酶解时间对蛋白去除率的影响

在温度60℃，酶用量2.0%，pH 5.0时，分别测定酶解时间为 0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，3.0h，4.0h 的蛋白去除率,蛋白去除率在一定范围内随酶解时间的延长而增加，1.5h后，蛋白去除率趋向平稳（图5）。因此，选用1.5h作为最佳酶解时间。

图4 p H对蛋白去除效果的影响

图5 酶解时间对蛋白去除率的影响

2.5.4 温度对蛋白去除率的影响

当酶用量2.0 %，pH 5.0，酶解反应时间1.5 h时，分别测定酶解温度为40℃，50℃，60℃，70℃，80℃时蛋白去除率，酶的活力在一定范围内随温度的升高而增高，温度超过60℃后，酶活力下降（图6）。因此，反应的最适温度应为60℃ 。

图6 酶解温度对蛋白去除率的影响

在兼顾蛋白去除率和多糖损失率的情况下，在考察单因素的基础上对酶法设计正交实验来优化除蛋白的工艺。

2.5.5 酶法除蛋白工艺优选

在单因素考察的基础上，选取酶用量（A）、pH（B）、温度（C）、酶解时间（D）为考察因素，每个因素考察3个水平，进行正交实验，以蛋白去除率优选木瓜蛋白酶法除蛋白的工艺，因素和水平见表1。

表1 酶法除蛋白工艺因素水平Table1 Factors and levels of removing protein by enzyme method

由直观分析结果可以看出4个因素对蛋白质去除率的影响程度不同，依次为A＞D＞C＞B，故以B作误差项进行方差估算，结果见表3。A因素和D因素对蛋白去除率都有显著性影响，C因素无显著性影响。最佳条件为A2B1C2D3，即酶用量2.0%，pH 5.0，温度60℃，时间2.0h，在该条件下蛋白的去除率为91.12%。

表2 酶法除蛋白工艺L9正交试验及结果Table 2 Results of L9(3)4 orthogonal test of removing protein by enzyme method

表3 蛋白去除率方差分析Table 3 Analysis of variance of PRP

2.5.6 工艺验证

按酶法除蛋白的最佳工艺对同一批多糖提取液进行验证（n=3） ，蛋白去除率分别为89.56%、90.15%、91.23%，多糖损失率分别为5.25%、5.69%、6.03%。3次结果均处于较高水平, 说明该提取工艺是可靠的。

3 讨论

Sevag法需要多次重复操作，多糖损失量大，成本高；三氯乙酸法多糖损失率较高可能是含有氨基易形成复盐降低其溶解度，并且以上方法都引入了大量有机试剂，易造成有机残留，不宜大规模应用。木瓜蛋白酶法效率高，条件温和，蛋白去除率和多糖保留率都很高，不引入有机试剂，因而能够较好应用于工业生产中，能为多糖类药品和保健产品的开发提供有利条件。

[1] 王长云,管华诗.多糖抗病毒作用研究进展Ⅰ：多糖抗病毒作用[J].中国生物工程杂志， 2000，20（1）：17.

[2] 刘合民,郑红霞.野生荠菜及其人工栽培技术[J].北方技术，2006（5）：93.

[3] 方升平，王维香，雒小龙.川芎多糖除蛋白方法研究[J].时珍国医国药，2009，20（9）：2176.

[4] 陈占科,王淑美,高珊，等.制何首乌多糖的脱蛋白研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（4）：41-43.

[5] 张慧玲,任秀莲,魏琦峰，等.海带多糖的脱蛋白研究[J].中成药，2008，30（9）：170.