异性孪生不育研究进展

宫昌海，马 桢，韩春梅，艾布什，胡晓龙，沈 波，孙献莹，武延风，高庆华*

（1.新疆巴州畜牧工作站，新疆 库尔勒 841000；2.塔里木大学动物科学学院 新疆 阿拉尔 843300；3.新疆畜牧科学院 新疆 乌鲁木齐 830000）

异性孪生不育研究进展

宫昌海1，马 桢3，韩春梅2，艾布什3，胡晓龙1，沈 波2，孙献莹2，武延风2，高庆华2*

（1.新疆巴州畜牧工作站，新疆 库尔勒 841000；2.塔里木大学动物科学学院 新疆 阿拉尔 843300；3.新疆畜牧科学院 新疆 乌鲁木齐 830000）

本文综述了当前的异性孪生不育生物学、诊断和非牛物种发生状况的研究。异性孪生胎儿胎盘间血管发生联系导致XX/XY间性嵌合体，而雌性胎儿生殖器发生雄性化导致不孕。异性孪生不育是最常见的牛间性形式，偶尔其他物种。建立早期诊断异性孪生不育的新的诊断方法的基础上检测Y染色体DNA片段的聚合酶链反应较常规核型分析和临床检查显示灵敏度和效率的改善，异性孪生不育检测有较大的经济重要性。新的异性孪生不育主要在异性孪生嵌合体形成机理、缪勒氏管抑制物(MIS)抗癌应用、移植免疫学和致突变致畸形研究领域。

异性孪生；不育；研究进展

1 异性孪生不育是间性嵌合体

异性孪生不育或自由马丁 (Freemartin） 是牛最常见的间性嵌合体形式（intersexuality，masculinisation），偶见于其他物种。不使用性控技术情况下，异性孪生雌性不育是牛和羊生产系统中繁殖多个后代一个限制因素[1]。异性双胎胎盘血管连接导致XX/XY嵌合体的发展，并最终有雌性生殖道不同程度间性嵌合体，导致雌性不育[2,3]。影响雄性动物的嵌合出生共同双胞胎的freemartin是有争议的，主要在是否影响生育，如果生殖细胞嵌合确实发生，是否有任何实际影响及后代性别比例[1]。

2 异性孪生不育的研究现状

Tandler和Keller在1911年首先对牛异性孪生型报道，并作出正确的解释，同样解释也被Lillie在1916年独立发现。因为Keller和Tandler的文献发表在兽医杂志，没有广泛的传播，在整个科学界的影响较小。Lillie是一个有影响力的科学家并且有一群研究生持续从事这方面的研究工作，他们的论文发表在”科学”杂志，而Lillie被认为获得这一发现，他们陆续发表了一些异性孪生方面的研究文章，为脊椎动物性别分化研究奠定了基础[4]。对异性孪生不育及性别分化的研究主要在形态学、细胞学和分子生物学三个方面展开，牛的异性孪生为主要的研究模型。

2.1 异性孪生不育组织学和形态学

异性孪生胎儿胎盘发育过程中血管发生联系，产生XX/XY型嵌合体，主要表现是雌性胎儿的生殖器官发生不同程度变化。Peretti在测量和观察牛Freemartins生殖器的结果显示[5]，阴户和阴道的长度低于正常（分别为6.4 cm和8.1 cm）。 组织学上，多泡状性腺存在比正常雄性多泡状性腺有更加纤维状和较少腺体的组织，子宫变化范围从发育不全到正常，子宫内膜的腺体减少到正常。 性腺和间质细胞显示不正常细胞质和核，表明没有功能的状态。无分化的性索和丰富的间质细胞是雄化母犊性腺的明显特点，卵母细胞未被观察到，核型分析显示在所有异性孪生的X-Y的血细胞嵌合体。

母羊异性孪生中有睾丸样结构，分别在腹部和腹股沟的位置，性腺组织学结构有相似曲细精管和间质细胞，大部分结构源自中肾管（附睾和水泡腺体），部分母羊有小的未分化的性腺，缺乏卵泡或曲细精管样结构。雄性型自由马丁性腺免疫组化染色的 3beta-羟脱氢酶 （3beta–HSD,3beta-hydroxysteroid dehydrogenase）和碱性磷酸酶（AP,alkaline phosphatase）仅限于间质细胞样结构，比正常公羊的性腺和染色更广泛和深入，3beta-HSD和AP中有不明类型的细胞[6]。

2.2 异性孪生不育激素变化

抗缪勒激素（AMH,anti-mullerian hormone或MIS,mullerian-inhibiting substance）被认为是引起异性孪生综合征主要物质，是成长和分化因子 (TGFbeta)家族的一员，569个氨基酸的糖蛋白二聚体，AMH由未成熟的塞托利氏细胞和出生后的卵泡颗粒细胞分泌[7]。雄性胎儿的AMH在性分化扮演一个关键角色-导致缪勒氏管退化，引起雌性胎儿卵巢发育阻碍和雄性化。表达人的AMH基因鼠生殖细胞数字的最大的减少发生在16 d和诞生之间，当多数卵母细胞仍然进入减数分裂的细线期阶段，而正常卵母细胞已经到达了粗线期阶段。转基因鼠胎儿的卵巢的芳香化酶活动被减少了，AMH高水平削弱间质细胞类固醇分泌[8][9]。

牛26周大的胎儿异性孪生发现阳性AMH细胞，异性孪生母牛性腺分泌的AMH，阳性反应仅限于少数细胞分为‘鸟巢’的睾丸索样结构中，这个现象支持这种嵌合体起源细胞由雄性双胞胎迁移过来的，成年异性孪生母牛没有任何AMH阳性细胞[10]。在异性孪生母牛确定血浆睾酮，孕酮，抗缪勒激素的浓度来衡量从出生到青春期雌雄性正常的水平发现，雄性和异性孪生母犊牛有很高浓度的AMH（超过700 ng/mL），相反，雌性AMH浓度总是低于120 ng/mL，雄性头5个月AMH值保持稳定，异性孪生母牛的头两个星期大幅减少达到正常雌性的水平，这表明AMH起源于雄性双胞胎。年轻公牛的血浆睾酮浓度趋势与AMH相对，青春期睾酮上升相对于急剧下降AMH浓度。牛血浆AMH浓度奇高于其他哺乳动物，包括人类和鼠，所取得的结果值得比较内分泌功能方面研究[11]。

慢性地表达MIS在胚胎形成期间的基因改造的母鼠是出生没有子宫或输卵管和卵巢丧失生殖细胞并且退化，类似雄化牝犊的牛科动物的表现型。从非常高MIS表达的基因改造的公鼠被雌性化，可能在雄激素生物合成的改变。MIS介导的缪勒氏管管退化通过间质组织间接地发生，在异性孪生管退化本质上由雄性孪生的睾丸生产的AMH决定[12,13]。在鼠胎儿卵巢AMH没有触发在雄化牝犊性腺发生在怀孕的早期的睾甾酮生产[14]，雄激素可能从雄性双胞胎的其他物质扩散出现而不是从在雄化牝犊雄激素的内在生产[15]，在异性孪生中AMH的起源是雌性自身还是雄性睾丸抑或二者间而有之。

2.3 异性孪生不育染色体和分子生物学研究

胚胎性别分化过程中雄性激素的关键作用已被阐明，内分泌研究的进展促进我们对各种各样间性的认识，例如：雌性生殖器官雄性化和外周组织对雄激素不敏感。染色体和分子遗传学研究使我们能够定位这些性别分化相关基因，从而进一步认识间性现象发生的分子机理[16]。临床研究异性孪生不育母牛存在盲端阴道和原始卵巢和子宫的结构，同时存在原始包皮，阴茎和睾丸的雄性特征。雄性异性孪生不育，尽管存在XX细胞，有正常的雄性形态和外生殖器，其中一些有繁殖力。在这些个体的染色体脆弱的检测染色体畸变（CA：gaps,chromatid breaks and chromosome breaks）和姐妹染色单体交换（SCE,sister chromatid exchange），表现出较高比例的非整倍体细胞，在染色体畸变与对照组相比存在统计差异平均值差异[17]。一般认为染色体脆弱影响牛的繁殖性能，对异性孪生或有过乏情或流产的牛淋巴细胞培养和长臂的X染色体测定，发现断点主要是在长臂中段（X=0.52;Sigma=0.046），G带负染区长臂3区域[18]。而异性孪生不育的分子生物学研究主要在该症状的快速和早期诊断方面[19]。

2.4 其他动物的异性孪生不育

在牛上，几乎所有的异性孪生的母犊都是自由马丁，而对绵羊异性孪生不育的发生率很低。Brace等在对230个Rideau Arcott羊后代的血液基因组用SRY基因片段PCR扩增，只有10只存在雄性特异性基因被判定为自由马丁。进一步的PCR和FISH分析证实嵌合体公羊和母羊都存在异性细胞，对于母羊雄性细胞转移嵌合于非血细胞的组织中。SRY与AMH在母羊性腺中转录表达，而雌性XIST基因在嵌合体公羊的白细胞中有转录和表达，Rideau Arcott后代中性染色体嵌合比例约为4.35%，没有显著影响后代的性比率，嵌合体绵羊异性细胞可以迁移至非外周血组织中并且表现转录活性[20]。而相反性别细胞染色体两雄一雌三个成年绒猴，推断此嵌合状态由胎儿胎盘异性双胞胎之间吻合导致[21]。在结合临床和细胞遗传学分析意大利南部水牛异性孪生的研究中[22]，42头动物血细胞的研究中发现10个异性孪生，8个雌性中6个显示正常阴道和阴蒂形态，2个出现了一些雄性特征（紧骨盆）。两个雄性是正常的。5个雌性被直肠触诊和3个雌性直接观察交配后发现，内部生殖器官从完全缺乏（闭锁阴道）到苗勒氏管发育不全和没有（或萎缩）的卵巢，所有异性孪生雌性不育。鹿[23]和绵羊[3]的表现和生殖行为记录可以查出一定数量的行为的反常性，而一致的发现是所有动物都有比正常短的阴道。

3 异性孪生不育诊断

异性孪生的母牛绝大多数不育，需要加以确定和宰杀。对间期核进行荧光原位杂交程序（FISH）确定牛XX/XY核型嵌合体和标志异性孪生的母牛的方法快速，可靠，可用于早期诊断[19]，XX/XY嵌合体核型被染色体组型和FISH杂交分别分析，这些动物两个分析结果之间非常相似。目前胚胎性别鉴定试剂盒运用环介导等温扩增（LAMP）分析性染色体嵌合体异性双犊，外周血白细胞用于扩增雄性特异性DNA，当血液样本稀释1:1000时LAMP反应混合物的血红蛋白或血液凝固不影响浊度测量反应混合物检测扩增DNA，这一程序可发现存在的XY白细胞0.01%的雌性XX血细胞，胚胎性别鉴定试剂盒可用于敏感的检测性染色体嵌合体，使得探测Y染色体特异DNA在很短的间隔内完成（与PCR扩增比较），便于现场应用异性孪生诊断[24,25]。PCR为基础的测试有好处超过雄化母犊诊断当前方法[26]。建立牛异性孪生综合征检测XY细胞的PCR法，正常的血液稀释血液，Y染色体特异性序列，探测到浓度为0.1%，PCR方法被认为是有效和方便的快速诊断各种不同类型的牛异性孪生综合征[27]。

诊断怀孕小牛畸形或已死在经济上有巨大好处，E1和E2比P4更好预断显示胎儿在子宫内的状态和胎儿的数量的[28]，从牛的雄性胎儿、雌性胎儿和自由马丁胎儿的血清物质，可以推断死亡或被吸收孪生公牛胎儿导致孪生母犊的雄化性腺[29]。常规对血液和染色体分析能够判断异性孪生母犊，而建立测量阴道的长度的方法可以为小牛提供一种相对确定的诊断结论[30]。

4 异性孪生不育需要继续研究的问题

牛是典型的血液间性嵌合体，而其他物种则不同，探测确定嵌合体后代体内的雄性源细胞的方法还需要研究和探索。而研究发现，异性孪生嵌合体可能形成于胎盘血管吻合前，抗公牛CD34抗原抗体和Y染色体原位杂交分析，自由马丁牛胎肝存在公牛性造血祖细胞，表明这种细胞克隆扩增和分化形成于胚胎发育的早期阶段，胎肝造血干细胞的嵌合显然在胎盘血管吻合功能形成之前[31]。

异性孪生不育嵌合体在抗癌临床应用和移植免疫学，MIS或AMH在异性孪生的分子事件研究有利于其在抗癌临床应用（筛选有卵巢癌的病人和辨认表达感受器官[32]。骨髓移植(BMT，Bone marrow transplantation)导致给造血组织嵌合体，研究异性孪生不育嵌合体模型的抑制免抑反应和防止慢性排斥，可以使BMT接收病态和死亡率减到最小[33]。

异性孪生不育嵌合体可能致突变致畸形[34-40]，表现为器官缺失或发育不全，如没有子宫颈，阴道不发达，广泛的性腺形态学改变;没有皮质缺乏卵巢结构。精浆腺体包括被纤维结缔组织广泛包围发育不全腺体组织但看起来有管状结构，或直接表现为畸形，如直肠末端闭锁，肛门闭锁，闭锁阴道，非性染色体决定性别山羊模型。

辅助生殖技术如体外受精和胚胎移植，卵泡刺激素诱导排卵及宫腔内人工授精和卵胞浆内单精子注射技术实施中辅助孵化、细胞培养和同时移植的程序都可能增加细胞融合的机会，这种“机会假说”可以简单地解释非常罕见的双胎嵌合体，从这个角度看，对双胎的长期的后续研究是有必要的[41]。

参考文献:

[1]Padula AM.The freemartin syndrome:an update.Anim Reprod Sci,2005,87(1-2):93-109.

[2]Parkinson TJ,Smith KC,Long SE,et al.Inter-relationships among gonadotrophins,reproductive steroids and inhibin in freemartin ewes.Reproduction,2001,122(3):397-409.

[3]Smith KC,Parkinson TJ,Long SE,et al.Anatomical,cytogenetic and behavioural studies of freemartin ewes.Vet Rec,2000,146(20):574-578.

[4] Freeman G.Explaining the freemartin:Tandler and Keller vs.Lillie and the question of priority.JExp Zoolog BMol Dev Evol,2007,308(2):105-112.

[5]Khan MZ,Foley GL.Retrospective studies on the measurements,karyotyping and pathology of reproductive organs of bovine freemartins.JComp Pathol,1994,110(1):25-36.

[6]Smith KC,Parkinson TJ,Pearson GR,et al.Morphological,histological and histochemical studies of the gonads of ovine freemartins.Vet Rec,2003,152(6):164-169.

[7] di CN,Wilson C,Faure E,et al.Cloning,expression,and alternative splicing of the receptor for anti-Mullerian hormone.Mol Endocrinol,1994,8(8):1006-1020.

[8]Lyet L,Louis F,Forest MG,et al.Ontogeny of reproductive abnormalities induced by deregulation of anti-mullerian hormone expression in transgenicmice.Biol Reprod,1995,52(2):444-454.

[9]Vigier B,Watrin F,Magre S,et al.Purified bovine AMH induces a characteristic freemartin effect in fetal rat prospective ovaries exposed to it in vitro.Development,1987,100(1):43-55.

[10]Cabianca G,Rota A,Cozzi B,et al.Expression of AMH in female fetal intersex gonads in the bovine. Anat Histol Embryol,2007,36(1):24-26.

[11]Rota A,Ballarin C,Vigier B,et al.Age dependent changes in plasma anti-Mullerian hormone concentrations in the bovine male,female,and freemartin from birth to puberty:relationship between testosterone production and influence on sex differentiation.Gen Comp Endocrinol,2002,129(1):39-44.

[12]Behringer RR.Themullerian inhibitor and mammalian sexual development.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,1995,350(1333):285-288;discussion 289.

[13]Vigier B,Tran D,Legeai L,et al.Origin of anti-Mullerian hormone in bovine freemartin fetuses.J Reprod Fertil,1984,70(2):473-479.

[14]Vigier B,Watrin F,Magre S,et al.Anti-mullerian hormone and freemartinism:inhibition of germ cell development and induction of seminiferous cord-like structures in rat fetal ovaries exposed in vitro to purified bovine AMH.Reprod Nutr Dev,1988,28(4B):1113-1128.

[15]Cavalieri J,Farin PW.Birth of a Holstein freemartin calf co-twinned to a schistosomus reflexus fetus. Theriogenology,1999,52(5):815-826.

[16]Leroy F. [Hermaphrodites and intersexed individuals from myth to reality.Second part].Vesalius, 2007,13(2):77-81.

[17]Peretti V,Ciotola F,Albarella S,et al.XX/XY chimerism in cattle:clinical and cytogenetic studies.Sex Dev,2008,2(1):24-30.

[18]Llambi S,Postiglioni A.Localization of the fragile X chromosome break points in Holstein-Friesian cattle (Bos taurus).Theriogenology,1994,42(5):789-794.

[19]Sohn SH,Cho EJ,Son WJ,et al.Diagnosis of bovine freemartinism by fluorescence in situ hybridization on interphase nuclei using a bovine Y chromosome-specific DNA probe.Theriogenology,2007,68(7): 1003-1011.

[20]Brace MD,Peters O,Menzies P,et al.Sex chromosome chimerism and the freemartin syndrome in Rideau Arcott sheep.Cytogenet Genome Res,2008,120(1-2):132-139.

[21]Benirschke K,Anderson JM,Brownhill LE.Marrow Chimerism in Marmosets.Science,1962,138(3539): 513-515.

[22]Iannuzzi L,Di MGP,Perucatti A,et al.Freemartinism in river buffalo:clinical and cytogenetic observations.Cytogenet Genome Res,2005,108(4):355-358.

[23]Li C,Littlejohn RP,Corson ID,et al.Effects of testosterone on pedicle formation and its transformation to antler in castrated male,freemartin and normal female red deer (Cervus elaphus).Gen Comp Endocrinol,2003,131(1):21-31.

[24]Hirayama H,Katagiri S,Kageyama S,et al.Rapid sex chromosomal chimerism analysis in heterosexual twin female calves by Loop-mediated Isothermal Amplification.Anim Reprod Sci,2007,101(1-2):38-44.

[25]Kadokawa H,Minezawa M,Yamamoto Y,et al.Freemartinism among singleton bovine females born from multiple embryo transfer.Theriogenology,1995,44(2):295-306.

[26]Ennis S,Vaughan L,Gallagher TF.The diagnosis of freemartinism in cattle using sex-specific DNA sequences.Res Vet Sci,1999,67(1):111-112.

[27]Fujishiro A,Kawakura K,Miyake YI,et al.A fast,convenient diagnosis of the bovine freemartin syndrome using polymerase chain reaction.Theriogenology,1995,43(5):883-891.

[28]Patel OV,Hirako M,Takahashi T,et al.Sex steroid levels throughout gestation in cows carrying normal and malformed fetuses.JVet Med Sci,1995,57(4):659-663.

[29]Wachtel SS,Hall JL,Muller U,et al.Serum-borne H-Y antigen in the fetal bovine freemartin.Cell, 1980,21(3):917-926.

[30]van HH. [Twins in cattle.Freemartin or not a freemartin?Preliminary Communication].Tijdschr Diergeneeskd,1982,107(23):905-906.

[31]Niku M,Pessa-Morikawa T,Taponen J,et al.Direct observation of hematopoietic progenitor chimerism in fetal freemartin cattle.BMC Vet Res,2007,（3）:29.

[32]Teixeira J,Donahoe PK.Molecular biology of MIS and its receptors.JAndrol,1996,17(4):336-341.

[33]Jankowski RA,Ildstad ST.Chimerism and tolerance:from freemartin cattle and neonatalmice to humans. Hum Immunol,1997,52(2):155-161.

[34]Pailhoux E,Vigier B,Vaiman D,et al.Ontogenesis of female-to-male sex-reversal in XX polled goats. Dev Dyn,2002,224(1):39-50.

[35]Hafez SA,Huckle WR,Caceci T.Anatomical,histological and genetic investigations of a sexually anomalous goat.Vet Rec,2005,157(17):513-516.

[36]Pailhoux E,Vigier B,Vaiman D,et al.Contribution of domestic animals to the identification of new genes involved in sex determination.JExp Zool,2001,290(7):700-708.

[37]Pailhoux E,Vigier B,Chaffaux S,et al.A 11.7-kb deletion triggers intersexuality and polledness in goats.Nat Genet,2001,29(4):453-458.

[38]Monteagudo LV,Arruga MV,Bonafonte JI,et al.Bilateral Leydig cell tumor in a six-year-old intersex goat affected by Polled Intersex Syndrome.Vet Pathol,2008,45(1):42-45.

[39]Batista M,Gonzalez F,Cabrera F,et al.True hermaphroditism in a horned goat with 60XX/60XY chimerism.Can Vet J,2000,41(7):562-564.

[40]Vaiman D,Schibler L,Oustry-Vaiman A,et al.High-resolution human/goat comparativemap of the goat polled/intersex syndrome (PIS):the human homologue is contained in a human YAC from HSA3q23. Genomics,1999,56(1):31-39.

[41]Miura K,Niikawa N.Domonochorionic dizygotic twins increase after pregnancy by assisted reproductive technology.JHum Genet,2005,50(1):1-6.

Progress in the Freemartin Syndrome

GONG Chang-hai1,MA Zhen3,HAN Chun-mei2,AIBUSHI3,HU Xiao-long1,SHEN Bo2, SUN Xian-ying2,WU Yan-feng2,GAOQing-hua2
(1.Bazhou Animal HusbandryWorkstation，Koyla 841000,Chana; 2.Collage of Animal Science,Tarim University,Alar 843300,China; 3.Animal Science Academy of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi830000,China)

This review considers the current state of knowledge of freemartin biology,incidence,experimental models,diagnosis,uses for freemartins in cattle herds,occurrence in non-bovine species.Freemartins arise when vascular connections form between the placenta of developing heterosexual twin foeti,XX/XY chimerism develops,and ultimately there ismasculinisation of the female tubular reproductive tract to varying degrees. The freemartin condition represents themost frequent form of intersexuality found in cattle,and occasionally other species.There will be greater economic importance to establish early diagnosis of the freemartin and the detection of the less common single born freemartin.New diagnostic methods based on the detection of Y-chromosome DNA segments by polymerase chain reaction show improved assay sensitivity and efficiency over karyotyping and clinical examination.Potential new research areas are discussed,such as detection of foetal DNA in maternal circulation for prenatal diagnosis,discussion of themechanism of freemartin,application of the anti-tumour properties of Mullerian inhibiting substance (MIS)and investigation of the trans-plantation immunology and teratology.

freemarlin;syndrme;progress

S814.8

A

1003－6377（2012）04－0037-05

2012-07-29

兵团科技计划项目(2011BD050)；塔里木大学校长基金创新群体项目（TDZKCX201201）

宫昌海 （1968-7），男 ，本科，研究方向：家畜育种 。

高庆华（1970-），男，博士，教授，研究方向：动物基因工程。