干眼动物模型制作的研究进展

刘 莉，何慧琴

(南京市中医院，江苏 南京 210001)

目前在对动物实验的研究中发现，药物作用、环境因素、改变性激素水平、营养因素、摘除泪腺或破坏睑板腺功能等均可导致干眼症。干眼动物模型主要可分为泪液缺乏型和蒸发过强型2种，介绍如下。

1 泪液生成不足型干眼模型

1.1 药物因素 研究发现，副交感神经兴奋可以使泪液分泌增加，如果阻断神经兴奋，就可以降低泪液分泌,阿托品是一种常用的副交感神经受体阻断剂。施炜等[1]利用1%阿托品滴眼液，以4次/d的方式给兔点眼，在7 d后兔的泪流量达到最低点，直到第14天泪流量基本无明显异常，角膜染色检查在11 d内角膜荧光素染色增加，但用药14 d后角膜荧光素染色与用药前相比，则差异不大，实验结果说明随着时间的延长，干眼症状表现越不明显，这种方法不能使观察对象长期维持在一个理想状态，不可用于长期的实验观察。东莨菪碱是从莨菪类植物中提取的具有抗胆碱活性的生物碱，与阿托品的中枢作用强的特点不同，氢溴酸东莨菪碱是一种外周作用较强的抗胆碱药。仇晶晶等[2]在兔的皮下注射氢溴酸东莨菪碱诱导兔泪液分泌减少，给药后1 h,实验组泪液分泌量明显减少，在实验早期药物完全代谢之后，发现泪腺分泌量下降程度有限，持续给药的高剂量组第14天出现泪液分泌量明显下降，并且随用药时间延长，泪液分泌量减少更为显著。结果提示造模过程中，泪腺分泌功能的改变与注射药物的剂量密切相关，2.0 mg/次,每天注射4次的给药模式可有效维持氢溴酸东莨菪碱的外周浓度，从而抑制泪腺的分泌，导致干眼的发生。这种方法在持续给药后期，会出现泪液黏液蛋白胶层的破坏，泪膜稳定性下降，在眼表无法形成完整泪膜，进而发生角膜上皮点状脱失。这说明了皮下注射氢溴酸东莨菪碱引起的干眼以出现的泪流量的减少为主,并且伴有免疫性炎症和细胞凋亡影响干眼模型。李晶等[3]使用高渗盐水分别对对照组采用308 mOsmol/L氯化钠溶液点眼,每日5次，实验组采用500 mOsmol/L氯化钠溶液点眼，每日5次，空白组不点眼方式造模，第0天各组间比较无统计学意义，第7天起，小鼠出现泪液生成明显减少(P<0.05),角膜荧光素钠染色和虎红染色出现点、片状着色，角膜荧光素钠染色评分升高[3组分别为(0.9±1.2)、(0.5±0.7)、(1.4±1.6)，P<0.01]，泪液蕨类图形减少。第14天起，与空白组和对照组相比，实验组小鼠结膜杯状细胞计数减少[3组分别为(10.6±2.0)、(11.8±1.3)、(5.4±1.8)，P<0.01]。角膜上皮基底部细胞排列紊乱缺失，角膜上皮分层减少，出现空泡，角膜上皮层厚度减少[3组分别为(21.69±3.41)、(21.23±2.64)、(15.82±1.38)μm,P<0.05]，角膜上皮细胞微绒毛丢失。第42天后，Shirmer实验观察较第0天下降66%，角膜荧光素染色从第7天起实验组染色评分比第0天上升了75%,总体观察泪液渗透压升高可以在小鼠眼表引起类似于干眼的病理损害。

1.2 手术造模 李森等[4]利用水合氯醛将大鼠全身麻醉后,在左耳下方约1 cm处沿皮纹做横切口，暴露皮下见一微黄色圆形腺体(眶外泪腺)，分离周边包膜将其完整摘除后缝合，再将左眼外侧1 cm处做纵行切口，暴露皮下见一白色质硬膜，切开见下方一三角形腺体(眶内泪腺)，将其完整摘除后缝合，术后1周Shirmer试纸湿长呈下降趋势,术后2周与术前比较有显著差异，荧光素染色自术后2周开始较术前明显升高，至术后4周更为明显稳定，说明干眼模型制做成功。在目前的实验研究中，“去势”是常见的一种降低性激素的方法，此法主要通过睾酮水平降低，泪腺上皮细胞萎缩,杯状细胞减少而产生干眼。姚小磊等[5]在造模过程中，将实验兔固定后，经腹正中切口逐层切开进入腹腔，切除双侧卵巢，对照组不切除卵巢只打开腹腔，术后连续缝合腹壁各层，45 d后观察发现,实验组BUT时间缩短、Shirmer试验减少、泪膜稳定性降低以及局部炎性反应因子和细胞凋亡相关基因蛋白表达增强、IL-1β与TNF-α大量表达于细胞膜和细胞浆中。这种方法简单易行，完全符合干眼症的病理表现。Zhu等[6]切除一侧泪腺，并在切除的泪腺的上皮细胞中培养自体外周血淋巴细胞5 d后，然后把自体外周血淋巴细胞注入兔的另一侧泪腺中，2周后诱导出类似于人类Sjogren综合征的自身免疫干眼症状。这说明了这些自体外周血淋巴细胞是起到抗原提呈细胞作用，其中主要是CD4+T细胞的炎性浸润作用，但是这种方法操作复杂,且对两侧泪腺造成严重损害,不利于自身的对照。王建仓等[7]在实验中用0.05 kg/L氯胺酮对12只雄兔进行肌肉注射全身麻醉，在雄兔阴囊皮下加用2%利多卡因局部麻醉，先后将双侧睾丸由腹腔挤入阴囊并捏紧，用消毒刀片将阴囊切一小口，且用力挤出睾丸，结扎精索静脉及输精管，切除睾丸及附睾，连续缝合后局部涂碘酊预防感染。术后8周后,动物模型的Schirmer试验、泪膜破裂时间差异性极显著，第12周后观察发现，动物模型的Schirmer试验、泪膜破裂时间、虎红染色检查均有明显干眼表现，但由于雄性激素水平的异常极易导致腺泡细胞表达自身抗原，引起炎症反应。

1.3 营养因素 维生素A的缺乏也可以出现干眼，维生素A中含有视黄酸、视黄醛、视黄醇等活性衍生物,可以维持正常视力和免疫系统。马轶群等[8]使用以干酪素为主的完全不含VitA的饲料喂干眼病模型组兔子，6个月后，实验组兔子的角膜干燥无光泽，Schirmer实验组兔显示均<10 mm，对照组兔均>20 mm。泪膜破裂时间显示实验组兔均<12 s，对照组兔均>24 s，实验表明，缺少维生素A可导致泪腺腺体萎缩，角膜上皮及结膜干燥引发干眼症。

2 蒸发过强型干眼模型

2.1 药物因素 Jester等[9]通过每天(约3次)对实验兔局部滴用肾上腺素，持续半年以上，兔的睑板腺导管才会出现角化，导致睑板腺导管狭窄或闭塞，泪液不能正常排出，从而出现睑板腺功能障碍。这种造模方式往往需要较长的时间，且成功率较低。黄佳等[10]用1.0 mmol/L的氢氯化钠溶液烧伤兔结膜后，其泪液分泌量未见明显变化，杯状细胞密度和黏蛋白含量在28天内有明显差异，泪膜破裂时间第7天下降明显,后逐渐延长，荧光和虎红染色术后第1天最明显，后逐渐下降。从实验结果来看,这种造模方式，症状持续时间较短，不常用于长期的实验观察。

2.2 减少瞬目频率 刘盛春等[11]在实验中分别用两个铁夹夹住实验兔双眼上眼睑正中近睑缘处毛发，并用丝线相互固定以此控制其瞬目运动。按同定时间(由实验前1 h瞬目次数的1/3计算)人为的使各兔瞬目1次，双眼操作相同，每天8 h(8:00～12:00，14:00～18:00)，其余时间待其休息进食，持续14 d，室内温度保持在20～23 ℃，相对湿度保持在40±10%，室内无明显噪音及气流干扰。14 d后，比较实验A组与对照C组，28天后观察实验B组，发现实验A组7 d和实验B组3 d泪流量明显减少,从第3天起，实验A、B组有大量的角膜荧光染色,BUT时间缩短，该模型主要通过减少瞬目频率，使泪液蒸发过多，泪液中黏蛋白缺乏，眼表组织继而干燥失活，角膜上皮细胞坏死缺损，由此引起角膜上皮屏障功能的损害而出现干眼的表现。

2.3 破坏睑板腺功能 Gifford等[12]采用灼烧封闭家兔睑板腺开口,导致睑板腺口堵塞，脂质不能正常排出，引起泪膜脂质层异常，从而形成干眼症。王晓冬等[13]在实验中，用烧灼器逐个烧灼模型组上下睑缘处所有睑板腺开口,每个开口烧灼时间约2 s烧灼后，摘除兔的第三眼睑，使泪液蒸发过强，泪膜不稳定，无法对眼表起到保护作用。这种方法对眼表的损害较大，可能造成睑板腺功能的不可逆性的破坏，而影响治疗睑板腺功能障碍药物疗效的观察。以上2种方法虽然制作过程简单，但是可能因为烧灼的温度和面积的大小，而对眼表组织产生不同程度的损害，影响泪腺的稳定性，不利于观察药物对睑板腺的治疗作用。

3 结语

目前，干眼症的发病机制尚未完全明确，且发病率较高，想要彻底根治比较困难，所以干眼症的动物实验研究是非常必要的。上述的几种动物模型的制作方法都各有其优缺点，实验人员应该根据自己的实验目的和实验条件选择合适的动物模型。虽然在制作干眼动物模型上有了很大的突破与改进，但是在制作过程中仍存在着许多的不稳定因素，急待我们去思考与研究，成功的制作出符合实验要求的动物模型，对于干眼的动物实验研究具有重大意义。

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