中药添加剂降低烟气悬凝物诱导16HBE细胞TNF-α、IL-8及气道黏液蛋白基因mRNA高表达的实验研究

魏民巍，郑赛晶，孟庆乃，金永明，周 昆，胡利民

(1.天津中医药大学中医药研究院，天津市中药药理学重点实验室，天津 300193;2.上海烟草(集团)公司技术中心，上海 200082)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是具有气流受限特征的呼吸系统常见疾病之一，其发病率和病死率逐年攀升。因出现气流受限且不完全可逆，呈渐进性进展，导致患者肺功能减退，劳动能力和生活质量下降，严重可致残，甚至死亡[1]。目前普遍认为吸烟是COPD的重要诱因[2]，而慢性气道炎症则是其重要的发病机制。有研究认为卷烟能通过诱导气道上皮细胞产生炎性因子，激活相关通路，继而诱导气道黏液蛋白基因(MUC5AC)高表达[3],气道黏液高分泌可加速患者肺功能下降。为降低吸烟造成的损伤，我们在烟草配方中添加中药成分提取液，制成卷烟。通过使用烟气悬凝物刺激人类支气管上皮细胞16HBE，建立细胞染毒模型，观察中药添加剂对卷烟诱导16HBE细胞TNF-α、IL-8及MUC5AC mRNA表达的影响，为中药添加剂在卷烟中应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 RPMI 1640培养液、胎牛血清、青链霉素为HyClone产品；0.25% EDTA-胰蛋白酶，Sigma；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒，日本同仁；TNF-α、IL-8 ELISA试剂盒，RD分装。RNA提取试剂盒，TIANGEN；cDNA合成、RT-PCR试剂盒，Applied Biosystems 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养方法 人类支气管上皮细胞系16HBE(来源中国医学科学院肿瘤细胞库)用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养。3～4 d传代1次，隔天换液。

1.2.2 中药添加剂卷烟及烟气悬凝物(CSC)的制备 本实验所用卷烟由上海烟草(集团)公司提供。中药添加剂卷烟制法如下：将生药材回流提取后减压浓缩，至生药材与浸膏之比为1∶1，加入浸膏3倍体积量的95%乙醇，24 h后抽滤，取上清液减压浓缩至稠膏。所得稠膏喷洒在烟丝上，烘干制成卷烟。所用药材以补中益气药为主，辅以清热润肺药。主要包括太子参、杭白芍、枸杞子、丹参、浙贝母等。采用国际主流的烟气悬凝物染毒细胞[4],以静电捕集法[5]收集烟气悬凝物，DMSO洗脱，样品稀释至50 mg/mL，分装至EP管于-80 ℃保存，实验时用RPMI 1640培养液稀释至所需浓度。

1.2.3 细胞活力检测 取指数生长期16HBE细胞，胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔200 μL接种于96孔培养板内,培养24 h。无血清培养基稀释CSC至200、100、50、25 μg/mL，每孔200 μL对细胞染毒。12、24 h后弃上清,每孔加100 μL CCK-8溶液(1∶10稀释),2 h后，多功能读板机测定在450 nm处的吸光度。计算细胞活力。

1.2.4 PCR法检测CSC染毒对16HBE细胞TNF-α、IL-8、MUC5AC mRNA表达影响 取指数生长期16HBE细胞，胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×105个/mL。每孔以2 mL细胞悬液接种于12孔板内，培养24 h,待细胞生长单层融合后，予以无血清RPMI 1640培养液饥饿24 h。以不同浓度的CSC对细胞染毒，每个剂量设3个平行孔，每孔终体积1 mL,37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养12、24 h。按RNA提取试剂盒说明书提取RNA，并计算其浓度，RNA浓度(μg/μL)=OD260读数×40×稀释倍数/100。按照cDNA反转录试剂盒说明书依次在PCR管中加入反应物，每管10 μL。加入RNA样品2 μg，用RNase-free water补足反应体系至20 μL。放入PCR仪进行逆转录，反应条件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min。按PCR试剂盒说明书依次在PCR管中加入反应物。反应条件：预变性95 ℃ 4 min，变性95 ℃ 30 sec，复性58 ℃ 35 sec，延伸70 ℃ 40 sec，30 cycles。应用7 500实时定量PCR仪分析软件，查看并分析数据，获得样品的Ct值，计算得到ΔCt，与对照组比较后，取2-ΔΔCt值进行数据统计。

2 结果

2.1 细胞活力 染毒后细胞活力显著下降，呈浓度依赖性。含添加剂组细胞活力高于普通烟组，当CSC浓度为100、200 μg/mL时，添加剂组细胞活力较普通烟组显著升高。

2.2 CSC染毒对细胞TNF-α、IL-8和MUC5AC mRNA表达影响 染毒后，TNF-α、IL-8 mRNA表达增多，呈剂量效应关系。添加剂组低于普通烟组，但无统计学意义。染毒12 h后,MUC5AC mRNA表达增多，呈剂量效应关系。添加剂组显著低于普通烟组。染毒24 h后,添加剂组低于普通烟组，无统计学意义。

3 讨论

烟气细胞毒性是指在烟气直接造成细胞死亡的毒性作用，即细胞一次或一段时间内多次接触烟气后出现的细胞死亡现象。结果表明，添加剂组细胞存活率高于普通烟组,当CSC剂量大于100 μg/mL时有统计学意义,表明中药添加剂具有降低CSC细胞毒性的作用。大量研究证实烟气中的大量自由基不但可以直接破坏细胞内氧化平衡，而且可诱导气道上皮细胞多种细胞因子表达增多，这些炎症介质相应基因的表达活性主要是受核转录因子(NF-κB),CCAAT/增强了结合蛋白(C/EBP)和激活蛋白复合体-l(AP-l)的调控[6]。香烟烟雾刺激人呼吸道上皮细胞，可诱导白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)[7]和TNF-α的表达增加[8-12]。这些炎症因子可诱导中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等向气道内浸润，放大炎症反应，造成气道慢性炎症和持续损伤。因此比较不同卷烟烟气悬凝物染毒后细胞TNF-α及IL-8表达对评价中药添加剂降低卷烟危害作用具有重要意义。此外，香烟还是诱导气道黏液高分泌的重要因素，可诱导气道黏液蛋白基因(MUC5AC)高表达[13-14]。气道黏液高分泌是慢性气道炎症的一个重要的病理特征，气道黏液堵塞是导致发病和死亡的一个主要原因。故将中药添加剂作为是否能降低气道黏液蛋白基因表达评价标准之一。实验结果显示CSC染毒后细胞TNF-α及IL-8 mRNA表达在一定浓度和时间范围内呈药物浓度和时间依赖性表达增加。染毒后TNF-α及IL-8含量及mRNA表达下降，但均无统计学意义。CSC能诱导16HBE细胞MUC5AC mRNA高表达,染毒12 h后，添加剂组显著低于普通烟组。染毒24 h后，添加剂组低于普通烟组，无统计学意义。此结果表明添加剂可降低气道黏液蛋白基因表达，其是否能够减少吸烟所致呼吸道黏液高分泌有待进一步的证实。由于添加剂有效成分经燃烧后转化率较低，其作用效果亦有待提高。

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