猪博卡病毒检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，沈志强

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062）

博卡病毒（Bocavirus）为细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属成员，博卡病毒属包括牛博卡病毒、人博卡病毒（1型～4型）、犬博卡病毒（1型）和猪博卡病毒4种［1］。人博卡病毒最早于2005年在一名表现下呼吸道疾病的瑞典儿童体内经PCR技术被首先鉴定，其基因组大小为5.2kb左右，为无囊膜单股线状DNA病毒［2］。目前，已有许多国家报道人博卡病毒病的流行［3］。猪博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）则于2009年首次由瑞典科研人员从表现断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的瑞典发病猪群中被检出并鉴定［4］。目前，猪博卡病毒作为新发现的病原，已成为世界各国科研人员研究的热点。研究表明，猪博卡病毒除了与细小病毒科其他成员同有2个开放阅读框架（ORF1和ORF2）外，还在非结构蛋白和结构蛋白编码区之间有第3个开放阅读框架（ORF3），编码1个高度磷酸化的功能尚未弄清的非结构性蛋白质。ORF1编码1个与病毒基因复制有关的非结构蛋白质，ORF2编码2个衣壳蛋白（VP1和VP2）。根据ORF2编码的VP1病毒蛋白的不同，已报道的6个猪博卡病毒可分为4个型（PBoV1～PBoV4）［5－6］。

1 博卡病毒的发现

2009年，瑞典科研人员运用随机多重置换扩增方法（random multiple displacement amplification，MDA）（病毒宏基因组研究方法之一）和高通量测序技术在患PMWS的猪淋巴结中扩增出了一段长1 879bp的核苷酸序列，将该段序列与已知病毒序列比较，发现其完整的NP1基因及部分VP1／VP2基因与人类博卡病毒相近，故将该病毒归类为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属［7－8］。

2 博卡病毒与疾病的相关性

目前，在欧洲一些国家和我国均已报道了PBoV在猪群中的流行状况，显示在健康猪群和表现呼吸道症状的猪群中均检出较高的阳性率，可见其流行面很广。由于对PBoV的研究才刚刚起步，对其全基因组大小、体外培养细胞系、物理化学性质、传播途径等方面都不甚明了，因而其单独的致病性不得而知。但PBoV在病猪体内被检出，暗示其对猪有一定的致病性。多数（PBoV1、PBoV2及PBoV4）分离自患PMWS的病猪，并且在病猪的检出率高于健康猪。这表明PBoV与PMWS的发生有一定相关性，其也可能与猪圆环病毒2型（PCV－2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）等病原混合感染导致猪发生更严重的疾病［9－10］。自2006年，我国暴发猪高热病以来，其主要病原被确定为PRRSV，但在PRRSV阳性的病料中也频繁地检出PCV－2、猪伪狂犬病病毒（PRV）及CSFV等，而在这些病料中PBoV也被检出，而且阳性率大于70%以上，并且病猪表现明显的呼吸症状及肺组织损伤。这表明PBoV可能在猪高热病中也扮演一定的角色，其致病机理有待于进一步研究［11］。2010年至今中国部分地区规模猪场暴发流行的仔猪严重腹泻，哺乳仔猪多在出生2d～3d后出现剧烈的腹泻，呈黄绿色、淡绿色或灰白色水样粪便，部分仔猪有呕吐症状，迅速脱水消瘦，病猪精神沉郁、被毛粗乱，少吃或不吃、脱水消瘦，一般于5d～7d内死亡，10日龄以内的仔猪死亡率高达50%～80%，随日龄的增加死亡率降低。病死猪尸体消瘦、脱水、胃黏膜充血，有时有出血点，小肠黏膜充血，肠壁变薄无弹性，内含水样稀便，肠系膜淋巴结肿胀。同一猪场内母猪和育肥猪无明显症状。按照流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒处理，基本无明显效果。有些猪场调整免疫程序，做了猪瘟或者伪狂犬病乳前免疫接种，效果很差。一些学者也推测可能与PBoV感染存在关联。虽然尚未弄清PBoV感染的临床意义和流行病学特征，但值得关注和持续性监测。

3博卡病毒的培养与检测

3.1博卡病毒的培养

目前，只有北爱尔兰科研人员McKillen J等［12］对猪博卡病毒的细胞适应性进行了研究，其可以在猪原代肾细胞上生长且经过培养4代后，导致细胞出现明显的细胞病变。他们在北爱尔兰猪粪便样品的细胞培养物中分离到2株猪博卡病毒，经基因分型分析确认为PBoV3和PBoV4型。此外，该研究还对细胞培养液进行收集、梯度离心处理，电镜观察，结果发现分离的病毒直径大小为25nm～30 nm，与其他细小病毒亚科成员的病毒粒子大小相似。

3.2博卡病毒的检测

3.2.1聚合酶链反应 聚合酶链反应（PCR）检测方法是分子水平上常用的方法之一，具有很好的敏感性、重复性和特异性，已广泛应用于动物疫病的检测。瑞典学者Blomstrom A L等［4］（采用PCR技术对34头患PMWS的病猪和24头健康猪进行了PCV－2、猪输血传播病毒（PTTV）和PBoV的检测，结果PMWS病猪中PBoV阳性率为88%，而健康猪群阳性率为46%，说明PBoV可能在PMWS致病作用中参与了共感染。Cadar D等［13］（于2006年－2007年和2010年－2011年狩猎季节在罗马尼亚西部地区采集了842头份野猪样品，经PCR检测，共检出PBoV阳性样品109份，阳性率为12.94%，其中2006年－2007年狩猎的野猪样品的阳性率为9.14%（43／470），而2010年－2011年狩猎的野猪样品的阳性率为17.74%（66／372），显示出攀升趋势。不同年龄段野猪阳性率存在差异，其中6月龄～12月龄的野猪阳性率为77.06%（84／109），12月龄～36月龄的野猪阳性率为22.94%（25／109），说明PBoV感染主要发生在低年龄段猪群。经基因测序，表明野猪和家猪的PBoV基因同源性很高。国内翟少伦等［11］建立了PBoV1的PCR诊断方法，并对2009年来自江西、浙江等9个省市送检的191份疑似猪高热病病料（组织样品108份，血清76份和精液7份）进行检测，结果检出PBoV阳性样品75份，阳性率为39.3%（75／191），表明我国猪群中猪博卡病毒相当流行。他们建立的PCR方法敏感性、重复性和特异性均较好，敏感性达32.2ng／μL。Zhai S L等［6］对中国猪群中PBoV的感染情况进行了调查。经PCR检测，发现表现呼吸道病症的断奶猪PBoV阳性率达69.7%（69／99），其他猪群阳性率为0～13.6%，暗示PBoV可能在猪呼吸道疾患中扮演一定的角色。对部分VP1／2基因序列进行分析，发现与参考毒株同源性达99%～100%，仅在5个核苷酸位点发生突变。Zhang H B等［14］于2010年收集了中国10个省份的166份样品进行猪博卡病毒分型检测，结果PBoV1～PBoV4型的检测率分别为28.9%、6.6%、19.3%和39.7%，说明中国猪群中PBoV感染状况非常复杂。Lau S K等［15］从中国香港生猪屠宰场和养猪场的健康猪和病死猪中采集了淋巴结、血清和粪便等样品共333份，采用PCR技术检出PBoV阳性样品55份，总阳性率为16.5%。经对病毒全基因组序列的测定，表明存在2个型别的PBoV，即PBoV3和PBoV4，推测可能在猪体内不同PBoV毒株间发生了变异和重组。李彬等［16］建立了检测PBoV的PCR检测方法。阳性样品可出现约为270bp的片段。他们建立的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低，便于临床应用。总之，已经建立了越来越多的PBoV的PCR检测方法并被应用于临床样品的检测。

3.2.2 实时定量聚合酶链反应 实时定量聚合酶链反应（Real－time PCR）是在PCR的基础上建立起来的诊断方法，由于省去了普通PCR需要凝胶成像的步骤，可以大大缩短疫病的检测时间。Li B等［17］建立了检测PBoV的Real－time PCR方法，经对258份猪样品的检测，检出阳性样品114份，总阳性率为44.2%（114／258）。发病猪群的PBoV 阳性率明显要高，达56.1%（101／180），而健康猪群的阳性率则为16.7%（13／78）。他们建立的real－time PCR 方法，敏感性、重复性和特异性均较好，敏感性达20个质粒拷贝。黄律等［18］立的PBoV2 Taq Man荧光定量PCR方法，结果表明PBoV2最低核酸检出量为67.3拷贝／μL。

3.2.3 间接免疫荧光法 McKillen J等［12］建立了PBoV的原代细胞培养系统，同时为了鉴定病毒在细胞上的生长情况，还建立了间接免疫荧光方法，结果发现绿色荧光集中在猪原代肾细胞的细胞核。

3.2.4 环介导等温扩增（LAMP）技术 李彬等［19］建立了一种猪博卡病毒的LAMP检测方法并组装了检测试剂盒，该试剂盒包含4条引物，检测时首先按照常规方法提取待检样品的核酸，然后利用LAMP检测试剂盒检测样品核酸，从而判断样品中是否含有猪博卡病毒。他们研制的试剂盒使用简单，结果直观，特异性及敏感性高。

此外，李彬等［20］报道对PBoV1的NP1基因进行原核表达，研究结果表明NP1蛋白可作为诊断抗原的候选蛋白，这也为PBoV1的血清学诊断积累了材料。

4 结语

PBoV作为猪群中的一种新发现病原，自2009年以来，人类对它的研究正逐步深入。尽管在其病原学、流行病学、诊断方法等方面取得了很大的突破，但在其基因型分型、致病性、感染性克隆、稳定的体外培养系统、鉴别诊断方法等方面的研究还比较薄弱。虽然表明本病毒可能是猪呼吸道疾患的致病因子之一，并且与临床猪病发生具有潜在关联，常与PCV－2、PTTV和PRRSV等发生混合感染，但其致病机理以及在PMWS中扮演的角色需要进一步的研究。同时在健康猪群相关样品中也能检测到较高的博卡病毒阳性率，说明猪博卡病毒感染的广泛存在。因此，只有对其临床表现、致病机理、传播机制和基因遗传演化等方面进行更深入的研究，才能有助于对PBoV的真正认识和有效防控。相信通过科研人员今后更多的研究，我们会得到更多PBoV的相关知识。

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