应用RNAi技术防控猪病毒病研究进展

吕素芳，郭广君，王金良，谢金文，董炳梅，沈志强，＊

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600）

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指细胞利用外源性或者内源性的双链小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）激发相关的酶复合物对同源性mRNA进行切割、降解，从而在转录后水平阻断基因的表达，达到同源基因的减效表达或不表达。RNAi可看成是一种与免疫系统类似的防御机制，利用RNAi技术进行病毒感染的干扰试验已在植物及低等生物中取得满意的结果，但在动物体内的试验才刚刚起步。本文对RNAi的原理、猪病方面的研究现状、存在的问题及发展趋势进行总结。

1 RNAi的原理

1.1 RNAi的发现

RNAi最早是在1990年由Jorgonson R等人在矮牵牛花的研究中发现的。1995年康奈尔大学Guo S博士在线虫Par－l基因研究中意外地发现，给线虫体外注射正义RNA不但不增加该基因的表达，反而使该基因表达受到阻断。随后Fire A等解释了此现象，认为这种特定基因表达受抑制的现象是由于污染了微量dsRNA所引起的，正是这些dsRNA引起了基因沉默，并称此现象为RNA干扰（RNAi）。

1.2 RNAi的分子机理

RNA干扰包括起始阶段和效应阶段。在起始阶段，dsRNA被Dicer酶切割为21bp～23bp长的小分子干扰RNA片段（small interfering RNA，siRNAs），每个片段的3′端都有2个碱基突出。在动物细胞中，dsRNA可以通过转染、显微注射直接导入或者导入能表达dsRNA的表达载体［1］。细胞基因组中反向重复的DNA序列可转录生成dSRNA；细胞感染病毒后，病毒RNA复制过程中间体也能形成dsRNA。Dicer酶是RNaseH家族的一员，由一个解旋酶结构域、两个RNaseⅢ结构域、一个dsRNA结合结构域和一个PAZ结构域构成。Dicer切割产生siRNA的过程需要dsRNA结合蛋白 TRBP（trans－activating region－binding protein）和PACT（protected areas conservation trust）等蛋白分子形成蛋白复合体，并需ATP供能。有一部分siRNA进入合成、切割循环得到进一步放大，从而引发强烈的基因沉默效应。

RNAi效应阶段发生的关键，是siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物（RNA－induced silencing complex，RISC），包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶，RISC具有切割同源的靶mRNA的核酸酶活性，在距离siRNA3′端12个碱基的位置切割mRNA，产生基因沉默效应。

在抗病毒感染领域，RNAi技术可以防止病毒入侵、抑制病毒复制、减少病毒RNA数量、阻断病毒蛋白的表达，在各种疾病的基因治疗研究中，发挥出了巨大的潜力和独特的效果。目前，RNAi技术已经用于许多人的病毒性疾病的研究中，如人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）、流感病毒等［2－5］。RNAi技术在猪病中的应用研究也较多，其中2008年以前的研究进展笔者曾总结过［6］，本文主要对近4年的最新研究进行综述，现分别介绍如下。

2 RNAi技术抑制病毒的研究

传统的猪病防控技术近年来取得巨大进展，可是人们仍然希望探索新的防控方法。RNAi技术可以防止病毒入侵、抑制病毒复制、减少病毒RNA数量、阻断病毒蛋白的表达，在抗病毒感染领域，具有较大的潜力。RNA干扰对正链RNA病毒更为有效，因为正链RNA病毒的基因组是mRNA，可作为病毒复制的模板。猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）基因组均为单股正链RNA，存在大量的siRNA潜在靶位点，是应用RNAi防控的理想对象。

2.1 猪瘟病毒

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的是一种高度传染性和致死性传染病，不同品种和年龄猪都易感，给养猪业造成了严重的经济损失。目前尚无有效药物可以治疗该病的感染，RNAi技术有希望成为根除该病的方法之一。CSFV基因组是单股正链RNA，大小约12.3kb，基因组分为5＇UTR、开放阅读框（ORF）和3＇UTR三部分。其中ORF编码的多聚蛋白，经裂解形成4个结构蛋白（C、E0、E1、E2）和 多 个 非 结 构 蛋 白 （Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。针对CSFV的RNAi研究，近几年主要集中在 NS3、Npro、NS5B、NS4A、NS2、C等基因。

王铁东等［7］根据CSFV石门株Npro基因，构建shRNA逆转录病毒表达载体，转导猪胚胎成纤维细胞，筛选获得7个稳定整合shRNA表达构件的细胞株。通过间接免疫荧光及子代病毒滴度检测，结果有3个细胞株上CSFV的增殖显著降低，表明所构建的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制病毒复制。李江南［8］针对CSFV Npro、NS2、NS3基因设计了6个干扰靶位点，转染PK－15细胞，通过间接免疫荧光、荧光定量PCR、病毒感染滴度测定等方法进行检测，结果针对NS3基因的3个靶点能有效抑制CSFV复制和增殖，抑制率达85%以上。Xu X R等［9］针对CSFV的Npro和NS5B基因设计3组siRNAs，转染PK－15细胞后进行病毒感染，72h后进行间接免疫荧光检测，结果仅少数实验组细胞中能检测到病毒抗原，而对照组细胞大多呈阳性。通过实时荧光定量RT－PCR检测，siRNAs组细胞中病毒基因组拷贝数量减少4倍～12倍，病毒的TCID50降低467倍。结果表明，3个siRNAs能有效抑制病毒基因组复制和病毒感染，可抑制72h～84h。Li J等［10］针对CSFV的Npro和NS4A基因构建3个siRNA载体，转染PK－15细胞后筛选了稳定表达siRNA的细胞克隆。经感染病毒72h后检测，病毒基因组复制降低186倍。间接免疫荧光检测发现只有很少的细胞发生感染，抑制可持续至120h。表明RNAi技术可用于CSFV特定基因功能研究及潜在的治疗方法。Li J等［11］继续针对CSFV的NS3基因设计3个siRNAs、针对Npro基因设计2个siRNAs、针对NS5B设计1个siRNAs，使用相同或4个不同的启动子分别构建单一的、双重的、四重的siRNA表达载体。结果均能有效抑制病毒的复制，且针对不同基因的siRNAs共同使用时抑制效果最强，为抗CSFV的转基因猪研究提供了基础。Porntrakulpipat S等［12］根据CSFV Alfort株的核衣壳蛋白C序列设计siRNA，转染SK－6细胞后进行病毒感染试验。结果0.75μg siRNA即能明显抑制3.5 log10TCID50／mL剂量的病毒感染。

2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV引起的）一种高度传染性疾病。由于PRRSV嗜巨噬细胞性、遗传变异较快、免疫机制还不十分明确等特征，临床上常引起免疫应答较差、持续感染性及混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前对该病尚无特异有效的治疗药物。PRRSV基因组大小15kb，由8个开放阅读框（ORF）组 成，即 ORF1a，ORF1b，ORF2－ORF7。ORF1a和ORF1b被认为是编码复制和转录必不可少的酶，ORF2－7编码6个结构蛋白，即GP2，GP3，GP4，E，M，N。PRRSV RNAi研究较多的是ORF1b、ORF5、ORF6、ORF1a及 ORF7等。

Li G 等［13－14］构 建 了 4 个 携 带 S1 株 ORF1b、ORF5、ORF7基因的重组腺病毒介导的shRNAs表达载体。在Marc－145细胞内能有效降低特异基因的表达水平、抑制病毒复制，在猪肺泡巨噬细胞内也可有效抑制病毒复制，持续长达96h。其中针对ORF1b构建的载体rAd－P2，在 Marc－145细胞内能抵抗强毒SY0608株的感染。对26周龄猪肌肉注射针对ORF1b的shRNAs表达载体，24h后进行SY0608株攻毒。结果rAd－P2组猪血清和肺脏中的病毒含量很少，其临床病理症状也比阴性对照组温和，抑制作用明显。结果表明，构建的腺病毒介导shRNAs表达载体可体内体外有效抑制PRRSV的感染，为控制该病的感染提供了新的方法。Bao Y等［15］构建了20个针对强毒JXwn06株 ORF1b、ORF5、ORF6、ORF 7基因的siRNAs，筛选出了4个最有效。同时构建4个靶向ORF1b和ORF6的shRNA表达载体，转染Marc－145细胞后用强毒感染。结果4个载体均能抑制细胞CPE的产生，与对照细胞比，病毒滴度降低了1.7倍～600倍，其中针对ORF1b的2个载体抑制效果最强，分别为150、600倍。ORF1和ORF6表达水平降低，细胞内检测不到M蛋白。结果表明，RNAi在细胞内可有效抑制JXwn06强毒株的病毒复制，为抗PRRSV转基因猪研究奠定基础。Xiao S等［16］根据ORF5和ORF6基因序列，构建了5个表达microRNAs的重组质粒（amiRNAs），进行 MARC－145细胞内试验，结果amirGP5－370能显著抑制病毒增殖，而amir－GP5－370 和 amirM－263 则 效 果 不 明 显。2 个amirM－263s串联的双重表达盒与单一的amirM－263相比，对病毒的抑制效果更强。在MARC－145细胞中，可持续抑制病毒复制达120h。宋德武等［17］根据JL／07／SW 株 GP5基因，构建3个shRNA表达质粒，转染 Marc－145细胞6h后接种病毒。通过实时荧光定量RT－PCR、间接免疫荧光、TCID50等检测，结果构建的质粒可高效抑制病毒在细胞中的复制。杨闽楠等［18］构建了3个靶向N基因的siRNA表达载体，转染Marc－145细胞后接毒，结果可以高效抑制病毒增殖。说明GP5、N基因可能是病毒复制必需的，为PRRSV基因功能研究、抗病毒研究和转基因动物研究奠定了基础。Zhou F等［19］构建了5个靶向GP5和 M基因的shRNAs，结果针对ORF6e（261－279nts）的干扰质粒具有最高的抑制效率，达99.09%。同时，建立了重组shRNA质粒的Marc－145细胞系。这些研究揭示RNAi可作为潜在的治疗PRRSV的方法，针对GP5和M基因的shRNAs可作为RNA疫苗用于体内。

2.3 猪传染性胃肠炎病毒

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种高度接触传染的疾病，对首次感染猪群造成的危害尤为明显，短期内可引起各种年龄的猪发病，日龄越小，死亡率也愈高。目前对该病的防治以疫苗为主，但是疫苗手段不能彻底控制本病的发生。TGEV基因组为不分段的单股正链RNA，全长约28.5kb，其中5′端近20kb为基因1，编码病毒的聚合酶（RNA依赖的RNA聚合酶，RdRp），在病毒的转录和复制等关键环节中起着重要的作用。

周俊芳等［20－21］靶向聚合酶序列构建2个shRNA表达载体，ST细胞增殖试验表明，2个shRNAs质粒可有效抑制病毒复制，保护ST细胞免受病毒破坏，定量RT－PCR结果显示干扰质粒可显著减少培养物中病毒RNA的量，体外抑制效率达95%以上。对25d的SPF小型猪体内注射shRNA表达质粒，然后用TGEV感染。通过临床症状、组织病理学、间接免疫荧光、RT－PCR等检测，结果干扰组猪不同器官内的病毒含量均显著减少，能保护小型猪抵抗病毒的感染。表明特异的shRNAs可作为一种新的抗TGEV药物用于将来的研究。

2.4 猪圆环病毒2型

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV－2）属于圆环病毒科，具致病性，与断奶仔猪多系统衰竭综合征有关。PCV－2能造成免疫抑制，继而易发其他感染，给养猪业造成很大的经济损失，急需寻找新的有效的防治方法。PCV－2基因组为单股、负链、环状DNA，长1 767bp或1 768bp，11个ORF几乎都有部分重叠，其中ORF1编码复制酶（Rep），ORF2编码衣壳蛋白（Cap），前者与病毒基因复制有关，后者具有良好的免疫原性，是机体抵抗PCV－2感染的主要免疫原。

Wang H等［22］根据rep基因设计2个siRNAs、根据cap基因设计1个siRNA，插入含U6启动子的pSIREN－RetroQ ZsGreen载体，筛选获得5个阳性克隆。进行细胞内和小鼠体内试验，通过实时定量PCR和免疫组化检测，结果表明构建的干扰质粒可显著抑制病毒的复制，细胞内抑制效率达99%，小鼠体内抑制效率为26%～99%。李曼等分别针对rep、cap蛋白基因构建特异的siRNA表达质粒，转染PK－15细胞后20h感染PCV－2。结果siRNA在细胞中对PCV－2增殖具有很强的抑制作用，病毒滴度显著降低。针对不同位点的siRNA抑制效果不同，抑制时间可持续至感染后60h［23］。说明RNAi可以为抗PCV－2感染提供一种有效的治疗策略。

3 存在问题与发展趋势

RNAi被发现以来广泛应用于抗病毒领域，从癌症、传染性疾病、遗传性疾病，到呼吸系统疾病等［24－25］。体内外研究显示，只需很低的剂量就能达到显著、特异的效果，有望成为抗病毒治疗的有效方法。近年来，一些基于RNAi的抗病毒药物已进入临床试验阶段，这些病毒包括 HIV－1、HCV、HBV等，均取得很大进展。但是越来越多的研究发现，RNAi的治疗并不如人们一开始预想的那样顺利，病毒在不断进化以逃逸RNAi，人们要想在抗病毒治疗的临床方面取得成功，不得不重新考虑这些问题［25］。病毒可通过多种途径逃逸RNAi：①病毒靶位点区域突变。因为利用RNAi的治疗周期比较长，这也是筛选具有抵抗力的突变株的过程。突变通常在靶位区的1个碱基的置换或缺失，靶位点上游的突变也能导致逃逸。应尽量避免单个siRNA长时间治疗，可多个siRNAs同时使用，防止突变体的产生。②病毒RNA结构改变，使其基因组难以与RISC结合来抵抗RNAi作用。③病毒编码抑制因子或病毒蛋白修饰，这些蛋白可干扰RNAi机制中的特定步骤。不过由于RNAi具有显著特异的抑制作用，这种影响不是很严重。另外，利用RNAi的治疗效果无法预计，研究表明不是所有的siRNA都能产生同样的干涉效应，引起这种差异的原因目前仍不清。总之，RNAi技术应用与抗病毒病的治疗还面临着严峻的考验。只有解决这一系列的基础问题，才能使RNAi技术作为抗病毒的手段更多的用于临床，有望成为各种病毒性疾病预防和治疗的一个有效途径。

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