流感病毒受体结合与抗原性改变的分子基础

冯安林，涂镇波，张增峰，樊晓晖

（1.广西医科大学免疫学教研室，广西南宁530021；2.广西医科大学微生物学教研室，广西南宁530021）

A型流感病毒属于正黏病毒科，有8个片段的反义RNA链，编码11个蛋白，包括结构蛋白和一些非结构蛋白。流感病毒膜表面有2种重要的糖蛋白，即血凝素（hamegglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）蛋白，包括16种HA亚型和9种NA亚型［1］，任何一种HA和NA均可组成一种血清型。水禽类是所有16种HA亚型的A型流感病毒宿主，而人一般是H1、H2和H3亚型的流感病毒的宿主［2］。

进入20世纪以来，曾出现过几次大的流感部分暴发，比如1918年的西班牙流感、1957年的亚洲流感和1968年的香港流感［3］，被认为来源于禽类的流感病毒［2］。为什么会发生这种禽流感病毒跨种属传播到人，流感病毒又是依靠什么变异来突破这种屏障？随着目前关于流感病毒科研的进展，人们对流感病毒这类跨种属传播所需具备的分子变化基础也越来越清楚。

1 HA蛋白和唾液酸受体的结合特性

HA蛋白是A型流感病毒膜上的一个重要的糖蛋白，在病毒感染的初始阶段，它负责与宿主呼吸道或消化道上皮细胞膜末端带唾液酸的糖链结合［4］，是A型流感病毒接触和进入宿主细胞的关键。表观上的结构显示，HA在毒粒表面呈柱状刺突，由一个纤维状杆部和3个球状顶部组成，3个顶端各有一个“浅袋状”结构，这个浅袋状结构正好可以装入宿主细胞膜上糖链末端的唾液酸分子［5］。HA上的三个球状顶部是三聚体结构，每一个单体都是以多肽链HA0的前体形式合成，而HA0可被宿主细胞内的胰蛋白酶分解成HA1和HA2两个亚单位，球部主要是HA1单位，杆部主要由HA2和HA1的N、C末端组成，其中作为受体结合部位（receptor binding domain，RBD）的浅袋状结构位于HA1亚单位上，一般来说，位于RBD周围的氨基酸残基相对其它部位更易变异，而杆部的氨基酸则相对保守［6］。

唾液酸（sialic acid，SA），全称 N－乙酰神经氨酸，为一种单糖，细胞高尔基体内的唾液酸转移酶负责转移一分子的唾液酸至新的糖基受体，而流感病毒可以识别并结合这些细胞膜上的糖链［7］。唾液酸α2－3半 乳 糖 （SAα2－3Galβ）和 唾 液 酸 α2－6 半 乳 糖（SAα2－6Galβ）均以 C连接方式最常见，一般来说，人流感病毒结合在SAα2－6Galβ糖链上，而禽类流感病毒主要结合在SAα2－3Galβ糖链的受体上，所以如果发生一个种属到另一个种属的传播只会优先出现在这个种属的宿主兼有这两种受体分布的情况下［8］，有趣的是，猪流感病毒能同时结合在两种受体上，或主要结合在 SAα2－6Galβ序列的受体上［9］，正是这种流感病毒结合偏好的不同导致了异种间直接传播的障碍。进一步研究发现SAα2－6Galβ受体具有两种构象，Chandrasekaran A 等［10］用激光解吸电离飞行时间质谱分析发现，上呼吸道纤毛细胞具有很多长链结构的SAα2－6Galβ，可以根据结构分型出两种拓扑构型即圆锥和伞形。SAα2－3Galβ和短链的SAα2－6Galβ呈圆锥形，而长链的 SAα2－6Galβ呈伞形，后者扩大了与血凝素RBD的结合。随后的数据分析表明H1N1和H3N2可与伞形糖链结合，而H5N1只能结合圆锥形糖链，即便是最近变异的H5N1具有了与短链SAα2－6Galβ的结合，仍不能有效感染上呼吸道纤毛上皮，以致很难实现人与人之间传播。

2 流感病毒的基因重配作用

其他种类的流感病毒要想适应性改变获得感染人的能力，必须通过基因突变（抗原漂移）或基因重配（抗原转变），前者是病毒在宿主体内的适应性改变，而后者则是一个宿主细胞内感染了多种流感病毒，发生病毒基因片段的重配产生新的毒株［11］。自然界中有些动物可以同时感染人流感和禽流感病毒，它们被称之为中间宿主，猪最先被认为是中间宿主。Ito T等［12］用凝集素结合试验来观察鸭结肠和猪气管的唾液酸受体的分布情况，结果发现鸭结肠对 MAA（特异性结合SAα2－3Galβ）凝集素呈强结合特性，几乎不结合SNA（特异性结合SAα2－6Galβ）凝集素，而猪气管对这两种凝集素都有结合，提示猪能同时结合禽类和人流感病毒。这两种病毒都可在猪上皮细胞同时复制增殖，其可能原因为基因片段的重配，使得禽流感病毒选择性地获得人流感病毒相类似的结合特性，Hass J等［13］比对了469株分离自人、鸟和猪的H1N1亚型流感病毒的基因信息，并建立了进化树，同时在贝叶斯概率框架里推断出大部分跨种属传播的H1亚型流感病毒来源于猪，所以猪可以被看成制造基因重组流感病毒的“混合容器”［2］。事实上，通过基因比对和进化分析表明，2009年暴发的H1N1亚型流感病毒是一个三重排的A型流感病毒，来自禽类、猪和人的流感病毒在猪体内的重新整合，进一步验证了猪是“基因混合器”的这一说法［14］。

同样，确定人体内的唾液酸受体分布对了解流感病毒的结合感染起着至关重要的作用。Zhang Z F等［15］通过类似的凝集素结合试验发现人上呼吸道，如气管和支气管多为SAα2－6Galβ受体分布，而SAα2－3Galβ受体只有零星分布，但是在细支气管和气泡里SAα2－3Galβ受体明显增多。随后用 H5N1亚型禽流感病毒和人H3N2亚型流感病毒去感染各个截断的组织切片进行体外感染试验，发现其病毒结合部位与唾液酸分布特点基本吻合。这些试验结果一方面说明了禽流感病毒不易导致人感染的原因，另一方面又提示大剂量的禽流感病毒导致人感染，可能是通过结合了下呼吸道上的SAα2－3Galβ受体［16］。

但是，从1997年和1999年在香港暴发的禽流感H5N1和H9N2却是直接从禽类感染人，从那以后，整个亚洲对检测禽类体内的高致病性禽流感病毒的监督力度开始加大［17］，Duan L等［18］根据从家禽体内分离到的318株H5N1亚型流感病毒的全基因组信息，得到了44种不同的重组体，它们的HA和NA基因都来自一株 A／Goose／Guangdong／1／1996的H5N1亚型流感病毒，推测家禽也可能起着基因整合的作用。Yu J E等［19］的试验表明除水禽类鸭只有少量分布的SAα2－6Galβ受体外，陆禽类的鸡、鹌鹑和野鸡的呼吸道均表达较多的SAα2－6Galβ以及SAα2－3Galβ受体，这些常见的陆地禽类动物在重组流感病毒基因片段中起着一定作用，使得中间宿主这一概念得到进一步的拓宽。

3 流感病毒自身的基因突变

流感病毒可以通过基因重组或基因突变两种形式来适应性的结合在人呼吸道上皮细胞上，而后者可以通过特定氨基酸的改变引起病毒结合特性的改变，明晰这种变化对理解病毒结合特异性改变的原理和相关的预防监测都十分重要。Connor R等［20］用56株来自禽类、马和人体内分离到的H2、H3型流感病毒做唾液酸多糖链结合特异性的测定，结果表明具有人结合特性，即能结合到SAα2－6Galβ糖链上的血凝素的氨基酸残基226和228位分别是Leu和Ser，而来自禽类和马的226位和228位分别是Gln和Gly，这种L226Q和S228G变换了的病毒几乎只结合SAα2－3Galβ糖链，只有很微弱的人结合特性，这种氨基酸残基的双重差异彻底改变了H2和H3亚型流感病毒血凝素的结合特异性。事实上，H2血清型流感病毒的HA晶体结构表明，它的RBD周围环绕着4个二级结构，即190螺旋（残基190到 198）、220环 （221 到 228）、130 环 （134 到138）和一个155位的Thr，以及一些保守的芳香族氨基酸残基，如98位的Tyr和153位的Trp等围成［21］。Leu226的侧链疏水力排斥着Tyr98的苯环，同时Ser226与Tyr98上的羟基之间的范德瓦尔斯力促使Tyr98离开环220一定距离，延长了H2病毒HA的RBD区域。人上呼吸道长链伞形构象的SAα2－3Galβ更易于和在226，228位点替换了的病毒结合，突变造成了能在人与人之间传播的流感病毒。相类似的序列差异也出现在H3亚型禽流感病毒和H3亚型人流感病毒中，主要是人细胞受体上的Gal单位与HA上Leu226的疏水作用为H3亚型流感病毒提供了适度的结合亲和力［22］，病毒通过这2个位点的突变能有效地适应性感染人。

H1病毒也可以发生相类似的变异，Matrosovich M等［23］利用反向遗传学技术置换了一株在家畜流行的H1N1亚型禽流感病毒HA上的特定氨基酸残 基，通 过 Glu190Asp（E190D），Gly225Glu（G225E）的置换使病毒与唾液酸糖链结构特性从SAα2－3变为SAα2－6。到目前为止，只有 H1、H2和H3这3种流感病毒亚型可以通过2个位点的突变完全改变结合特性，这种发现更深入理解了流感病毒的跨种属传播所具备的结构基础。

H5N1亚型流感病毒属于高致病性禽流感，因为它的高死亡率，所以需监测防止其大规模感染人。Stevens J等［6］观察 H5N1病毒共晶体结构发现具有类似的190螺旋、130和220环，以及保守的芳香族氨基酸，但是做同样的类似H1的E190D、G225E变换或类似H2，H3的Q226L、G228S变换却不能观测到相类似的结合特异性的改变，只能降低SAα2－3的结合能力，却没能显著增加SAα2－6的结合。Yang Z Y等［24］用S137A和T192I的置换同时改变了H5病毒HA的130环和190螺旋，发现能够增加对SAα2－6的结合能力，但未能等同于上面H1和H3病毒类似的改变，可能是因为其结构更复杂，不能单纯地依靠改变RBD周围的氨基酸而产生作用。其它种类的禽类流感病毒还未发现这种依靠碱基适应性变异成人流感病毒的例子，但是这种增加与人结合能力的突变仍值得关注和监测。

4 抗原性的改变

流感病毒的抗原性随着变异而改变，它的抗原位点变异主要集中在RBD周围的区域，相对于这个区域，球状头部以下的杆状部分多为保守的氨基酸，其为介导细胞融合的关键。但是，机体免疫系统通常把目标定位在多变的头部，因此只能中和免疫的病毒和相近的毒株，如何让宿主免疫集中应答在这些保守的抗原表位上，成了制造更广泛有效流感疫苗的主要障碍［21］。

HA上的糖修饰影响着机体对病毒的免疫结合，例如从2004年－2005年里分离到的H5N1里都有变异Ala160Thr（A160T），其引入了一个新的N－糖基化位点Asn158，这个新引入的糖链对HA上的一个抗原表位产生位阻效应［6］，使宿主不能有效地对这些病毒进行识别和免疫攻击，对病毒起着掩盖的作用。Wang C C等［25］通过缩减 HA上的所有糖基化位点，使只剩下最后一个N－乙酰葡萄胺，发现它的结合特异性减小，但却增加了SAα2－3的结合力，可能是HA上的糖链的位阻效应产生了受体结合特异性，这种相对非特异性的病毒容易结合到人肺部的其他形式的多糖上，虽然加剧了受感染的危险，消失的糖链却暴露了HA杆部的保守序列，可以引起针对它的更强烈的免疫反应，这可以为制造更有效且广泛的病毒疫苗提供新的方法。

5 小结

近年年，禽类流感病毒跨种属传播到人的事件越显频繁，而隐藏在下面的分子机制则十分复杂，目前的研究主要集中在HA和宿主表皮的唾液酸受体的结合特异性上。通过凝集素组化和分子进化树的方法，发现了越来越多的可以同时感染人流感和禽流感病毒的中间宿主，它们起着“基因混合器”的作用，其具有产生适应性感染人的重组病毒的潜在威胁。而另一种威胁则来自病毒自身的基因突变，如H1、H2和H3血清型的禽流感病毒均可通过在RBD周围两个氨基酸的突变来适应性感染人，虽然这种变换形式在H5N1亚型等其他禽流感病毒中尚未发现，但是类似的增加SAα2－6结合能力的突变还是值得关注和监测。HA的变异同样可以引起流感病毒抗原性的改变，主要是由自身的糖修饰的改变所引起的，而根据这种变异的特性可以为制造更广泛有效的流感疫苗提供一个方向。但是，关于流感病毒结合特性仍有诸多问题尚未明了，比如H5N1亚型流感病毒能不能完全适应人，需要怎样的分子置换，还需进一步的研究。

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