禽腺病毒载体研究进展

赵 莉，周 洁，高 诚＊

（1.上海实验动物研究中心，上海201203；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；3.中科院上海药物所，上海201203）

最新的病毒分类第八次报告将腺病毒科分为哺乳动物腺病毒、禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAd V）、腺胸腺病毒、唾液腺病毒4个属。FAd V现在是指过去的Ⅰ群FAd V，包括传统FAd V及分离自鸡、火鸡、鹅和其他禽类的腺病毒，享有一种共同的群抗原。而以前被定义为Ⅱ群FAd V的火鸡出血性肠炎病毒、大理石脾病病毒及相关病毒现在统称为火鸡腺病毒A型，被归为新立的唾液腺病毒属。过去将与减蛋综合征有关的一类病毒定义为Ⅲ群FAd V，现定名为鸭腺病毒A型，被列入腺胸腺病毒属。由于FAd V多数呈隐性感染，不引起明显临床症状，被认为是活病毒载体的候选株。

1 FAd V基因组结构及功能特点

鸡胚致死孤儿病毒（Chicken embryo lethal orphan viru，CELOV）是FAd V的代表种，其基因组具有腺病毒科共有的一些特点：①DNA单链5′端结合着由腺病毒编码的末端蛋白，可提高腺病毒感染性。②DNA两末端各具一个40 bp～200 bp的abc……c′b′a′型的末端倒转重复序列（inverted terminal repeat，ITR）。CELOV 的 54 bp ITR 是DNA复制的起点。③ 包装信号φ位于所有已知腺病毒基因组左端100 bp～500 bp之间，在5′ITR附近。④位于基因组两端的ITR序列和左末端的包装信号序列共约500 bp是腺病毒的顺式作用元件，缺失后不能装配成有感染性的病毒粒子。

CELOV基因组全长43 804 bp，具有与人腺病毒（Human adenovirus，HAd V）序列同源的L区和E2区，位于基因组左中段，而不存在可识别的E1、E3、E4区。CELOV基因组左末端约5 kb和右末端约12 kb的序列富含开放性读码框（ORF），这些ORFs是否有类似于 HAd V E1、E3、E4区的功能，还有待验证。位于基因组794 bp处的ORF1编码一种功能上与d UTP焦磷酸酶同源的蛋白，位于基因组1 999 bp处的ORF2编码与细小病毒REP蛋白同源的产物，在基因组右末端的ORF8编码一种新型抗凋亡蛋白GAM－1，在阻断细胞凋亡方面的功能类似于Bcl－2和腺病毒E1B 19 ku蛋白。ORF22编码一种与E1A蛋白相似的产物，具有诱导凋亡活性，与视网膜神经胶质瘤蛋白相互作用。GAM－1蛋白和ORF22产物对DNA的有效复制起着重要作用，能激活E2F途径，促进细胞从G1期向S期的转化。在两端边界序列中，编码大于99个氨基酸的ORF有22个，已明确研究过功能的却不多，深入研究这些ORFs显得非常重要。

2 FAd V载体的研究现状

FAd V属包括12个血清型，其中CELOV（FAd V－1）和FAd V－8已完成了全基因组测序，在国外被广泛的用作FAd V载体研究。

2.1 CELOV（FAd V－1）载体

较早的研究对CELOV基因组序列和结构已有详细报道。Michou A I等［1］进行了CELOV基因组的突变研究，对含有CELOV两末端片段的质粒载体进行突变修饰和插入标记基因表达盒，并酶切线性化CELOV全基因组质粒，两者共转化大肠埃希菌发生同源重组，产生的重组腺病毒质粒经鉴定后转染鸡肝癌细胞系（chicken hepatocellular carcinoma cell line，LMH），监测各种突变后能否产生有感染力的重组病毒。结果鉴定了一系列可被缺失但需通过反式提供调节因子修复复制的病毒复制必需区和CELOV基因组右末端的一个复制非必需区（40 064 bp～43 685 bp），缺失该3 620 bp片段对病毒在LMH细胞和鸡胚上的复制没有可见的影响，并可用于承载外源基因。此外，该研究还证实CELOV载体有效转导多种哺乳动物细胞，有望替代HAd V5载体用于哺乳动物转基因研究。Francois A等［2］发展了柯斯质粒用作改良的载体构建系统，对CELOV基因组中22个未定义的ORFs中的16个进行了点突变来研究它们是否为病毒复制所必需。结果表明所有16个经过突变的CELOV都能在LMH细胞系上独立复制，包括基因组左末端的ORF1～4，12～15和右末端的ORF7～11，16～18，对于这16个ORFs的非必需性，研究者推测一方面可能由于它们在体外细胞水平不起作用而在病毒进入宿主体内后的全身作用中才体现功能，如与逃避机体免疫有关。另一方面，可能这16个ORFs与病毒其他基因（复制相关基因）在功能上具有同源性联系，缺失其中一个甚至几个导致的病毒功能丧失可被病毒自身平衡。最后，还有可能是化学诱变得到的LMH细胞系特别有利于CELOV的增殖，而使缺失ORF导致的功能异常不易被观察到或细胞因子偿代了这部分缺失的功能。Washietl S等［3］注释了CELOV基因组边界序列中ORFs的特征，有可能揭示FAd V与宿主间作用的新型模式。通过序列分析发现原属于平行进化同源基因群的一些ORFs出现了极大的功能偏离，包括 ORF2、ORF12、ORF13和ORF14，这些ORFs都具有一个极可能来源于腺相关细小病毒的ATPase／helicase区域，但均不具有ATPase／helicase功能。此外，还确认了ORF9、ORF10和ORF11为3个有IG类似区的假定的I型跨膜糖蛋白，具有补偿CELOV缺失的类似哺乳动物腺病毒具备的免疫调节功能。ORF16与脊椎动物单一ADP核糖体转移酶有较远的同源关系，故认为ORF16在CELOV生活周期具有免疫调节或类似功能。合并的ORF18／19编码了一个假定的甘油三酸酯分解酵素，由于它们只存在于FAd V和马立克病毒基因组中，可能在感染鸟类中具有特定的功能。Logunov D Y等［4］构建了一系列重组CELOV载体并证实即使在体内已有HAdv5抗体的情况下它们也能很好的将基因转入各种器官内。CELO－p53载体修复了p53基因抑制肿瘤活性的功能，既能在体外人肿瘤细胞中也能在移植裸鼠体内的异种移植物中发挥抗肿瘤活性，在裸鼠身上甚至伴随抑制肿瘤生长的作用。Francois A等［5］将VP2基因置于CMV启动子之下，分别插入到CELOV 基 因 组1 660 bp～1 989 bp 缺 失 区 和40 065 bp～43 685 bp缺失区，构建了表达IBDV抗原基因的重组病毒，通过皮下或皮内接种途径免疫，可保护SPF鸡不出现临床症状和死亡，但不能够提供完全的保护力避免法氏囊的病理损伤。Cherenova L V 等［6］构建了表达人白介素2（Ibperleukin－2，IL－2）基因的CELOV载体，但未对CELOV基因组有任何缺失。从体外培养的LMH和293细胞系上以及鸡胚尿囊液中均获得了重组病毒表达的有生物活性的IL2产物。在多次瘤内注射CELO－IL2重组病毒载体后，患黑色素瘤的C57BL／6小鼠的平均存活时间提高。对于该载体的实际应用，研究者建议去除与HAdv5致癌基因E1B和E1A有同源性的CELOV的2个早期基因GAM－1和ORF22。为提高CELOV载体对哺乳动物细胞内的转导效率，可以对CELOV的长纤突进行改造。构建缺失绝大部分病毒基因的无肠型CELOV载体也可延长外源基因的表达时间并提高载体的包装容量。在Le Goff F等［7］的研究中，CELOV 基因组右末端约3 620 bp片段缺失后，分别表达荧光素酶和分泌型碱性磷酸酶的重组病毒的体内效应被评估。鸡群经口鼻途径接种野生病毒和2种重组病毒后，结果病毒的组织生物学分布相似。尽管缺失基因组右末端的重组病毒在复制效率上有所降低，但其承载的异源性抗原能刺激宿主产生相应抗体。Shashkova E V 等［8］评估了表达 HSV1腺苷激酶（herpes simplex virus 1－thymidine kinase，HSV1－tk）的重组CELOV载体的抗癌效果。将HSV－TK或增强型绿色荧光蛋白（enhancer green fluorescebp protein ，EGFP）基因插入到CELOV基因组41 697 bp～43 669 bp处，缺失了1 954 bp的复制非必需区。CELO－TK载体既能将有功能活性的HSV1－TK产物转移到体外培养的肿瘤细胞系中，也能将EGFP和HSV1－TK基因转导至C57／BL6小鼠的皮下黑色素瘤内表达，与抗病毒药更昔洛韦联合用药，可抑制肿瘤生长。Stevenson M等［9］探索了用非基因性的聚合体包装CELOV，并用碱性成纤维生长因子重建靶向，实现了载体靶向性的有效改造，并可抵抗预先存在的免疫反应。Rauw F等［10］构建了表达鸡γ干扰素（chicken ibperferon－gamma，ChIFN－γ）的 复 制 型CELOV载体，ChIFN－γ表达框被插入到CELOV基因组右末端最大的复制非必需区D片段中。重组病毒表达的ChIFN－γ能很好地抑制溶细胞病毒在鸡胚成纤维细胞和激活的巨噬细胞上的复制，并且在体内外都很稳定。Barra C等［11］初步鉴定了CELOV的顺式作用元件。为定位CELOV基因组中编码病毒壳体化的基因，他们缺失了基因组80 bp～350 bp之间6个不同的区域来验证是否能产生活病毒。通过在初步确定的包装序列假定位置两侧插入Lox P位点，成功构建CELOV辅助病毒，同时建立了相应的表达Cre重组酶的LMH细胞系。结果表明基因组左末端200 bp～250 bp和250 bp～300 bp的区域对病毒包装分别起着很重要和必须的作用。重组FAd V载体的优点之一是可以利用鸡胚系统生产转基因产物。Tutykhina I L等［12］为开发有效的重组乳铁蛋白生产系统，参考前人［5］构建重组CELOV载体的方法，缺失了CELOV基因组40 045 bp～43 000 bp的复制非必需区并插入了包含人乳铁蛋白（human lactoferrin，h Lf）基因的表达盒。用该CELO－Lf重组病毒感染鸡胚，感染3 d后即可在尿囊液中检测到高表达的h Lf（每胚0.8 mg）。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白印迹分析和糖基化分析等方法对尿囊液生产的h Lf和人乳中天然乳铁蛋白进行比较，显示两者具有相似的功能活性。利用鸡胚系统生产这种结构和功能准确的h Lf产物，为以后将h Lf用作人用药物奠定了基础。

2.2 FAd V－4载体

Schonewille E等［13］将一株毒力很强的 FAd V－4在成纤维细胞系QT35上传代适应，得到了弱化毒FAd V－4／QT35。用弱化毒感染1日龄鸡，未出现临床症状和死亡。然后用鸡胚肝细胞上生长的FAd V－4肌内注射未接种弱化毒的21日龄的鸡群，结果出现了高死亡率，而在1日龄接种过弱化毒的鸡群未出现死亡。通过酶联免疫吸附试验和病毒中和试验分析，发现接种过弱化毒的鸡群中仅一部分鸡在攻毒前可检测到微弱的抗体反应，在攻毒后体内抗体滴度立即升高，另一部分鸡虽未检测到中和抗体仍受到了保护。而未接种弱化毒的鸡群在攻毒后抗体反应出现了延迟。这表明中和性抗体对于保护鸡群免受FAd V强毒感染不是必需的，此前未有FAd Vs存在此类现象的报道。Griffin B D等［14］报道了属于FAd V－C种群的FAd V－4全长45 667 bp的基因组序列，通过生物软件结合FAd V－A和FAd V－D种间序列保守性分析评估了FAd V－4基因组序列的蛋白编码潜力。46个潜在的编码蛋白的ORFs被认定，包括蛋白编码高潜力的33个ORFs和蛋白编码低潜力的13个ORFs。其中FAd V－4与腺病毒家族同源的基因，除了少数几个，均被认定为蛋白编码高潜力，而FAd V特有的的ORFs分为蛋白编码高潜力组和蛋白编码低潜力组。高编码潜力的基因包括之前报道过的fiber1基因、假定存在的10.3 kb和10.5 kb基因。对被认定为低编码潜力的且长度小于300 bp的上游ORFs中的数个进行了转录分析，表明这类在腺病毒科内普遍存在的上游ORFS可转录为重要的mRNA，可能属于翻译调节因子。这些结果有助于进一步明确FAd V－4的蛋白编码模式和新一代载体的开发。Mansoor M K等［15］为开发针对肉鸡心包积水症的有效疫苗，对FAd V－4弱毒活疫苗与商业化福尔马林灭活肝脏苗进行了肉鸡免疫效果的评估比较。分离自心包积水症患鸡的病毒分离株在鸡胚上盲传4代可获得鸡胚适应性，继续传代12次使其完全减毒成为弱毒活疫苗。分别用弱毒活疫苗与商业化灭活肝脏苗对不带母源抗体的14日龄肉鸡进行了免疫。在免疫后的第7、14、21天检测抗体水平，结果弱毒活疫苗免疫的鸡群与肝脏灭活苗免疫的鸡群相比，出现了显著的高反应性（P＜0.05）。对各组肉鸡在24日龄时攻毒，并连续观察了7 d。弱毒活疫苗对鸡群提供了94.73%的保护率，而肝脏灭活苗对鸡群仅提供了55%的保护率，与弱毒活疫苗比显著降低（P＜0.05），未免疫的对照组鸡群仅有10%的保护率。证明FAd V－4弱毒活疫苗能产生很好的免疫性，可控制鸡群心包积水症的感染。

2.3 FAd V－8载体

与CELOV 类 似，FAd V－8基因组中段与HAd V同源性高，含有大量结构蛋白基因，而在基因组左端6 kb和右末端13 kb与HAd V不存在同源性。Johnson M A等［16］将ChIFN－γ插入至FAd V－8基因组右末端一个编码CELOV 36 ku蛋白类似物的ORF缺失区，构建了3种重组病毒用于表达鸡生长因子。这3种重组病毒在鸡肾细胞生长特性表现出了差异，表明缺失编码36 ku蛋白类似物的ORF影响病毒在体外的复制。用表达ChIFN－γ的重组病毒接种鸡群，可增加鸡的体重。Johnson M A等［17］将禽传染性支气管炎病毒包膜突起蛋白S1亚单位基因表达盒分别插入FAV－8基因组Sna BⅠ和XbaⅠ位点之间的2.4 kb和SpeⅠ位点之间的50 bp的缺失区，获得了2株重组病毒。用重组病毒免疫商品仔鸡后，在35日龄时用不同血清型的禽传染性支气管炎强毒株攻击，可达到很高的保护率，显示了FAd V－8用于构建重组病毒预防禽传染性支气管炎的潜力。Greenall S A 等［18］将不同的转基因（scFv或scFv－Fc）分别插入到基因组右末端52 bp和2.3 kb缺失处，构建了两个FAd V－8载体。结果缺失2.3 kb基因的重组FAd V－8载体，成功表达了分泌型的scFv和scFv－Fc片段，均可在体内外中和禽法氏囊病毒。FAd V－8载体在禽体内传递和表达治疗性分子有较大的开发潜力。

2.4 FAd V－9载体

OjkicD等［19］研究表明，FAd V－9在基因组右末端存在两类串联重复序列区域，较长的重复区（the long tandemly repeated region），TR－2由13个连续的135 bp直接重复序列组成，功能未知。将EGFP报告基因插入到FAd V－9的TR－2区，获得了缺失TR－2的复制型重组病毒，证实了TR－2是FAd V－9的复制非必需区。在后续的工作中，Ojkic D等［20］又进一步研究了该重组病毒的体内作用。肌内注射接种野生型或重组FAd V－9后，检测了病毒在鸡体内的组织分布和抗体反应情况，两者的结果均相似，故TR－2区的缺失不影响FAd V－9在体内的分布和诱导相应的免疫反应。通过一系列基因缺失株的构建，Corredor J C等［21］分析了 FAd V－9基因组左末端400 bp～2 782 bp区域，此区域包含了包装信号功能域和一些ORFs。缺失了此区特定片段的活病毒在体外的生长特性与野生病毒基本类似，但是其中一株缺失了该区ORFs但保留包装信号功能域的病毒，在体内的复制特性未能达到野生病毒的水平，表明此区的一些ORFs尽管对于FAV－9的体外复制是非必需的，对病毒的体内复制却有重要的作用。Corredor J C等［22］又验证了 FAd V－9基因组左末端的复制非必需区，同时检测FAd V－9在体外的生长特性以及转导非禽源细胞的能力。在基因组左末端插入EGFP基因表达盒而未缺失任何区域构建了FAd V－9inEGFP，分别在基因组1194 bp～2 342 bp和491 bp～2 782 bp处插入EGFP基因表达盒构建了FAd V－9△1－EGP 和FAd V－9△4－EGP，这三株重组病毒均具有类似于野生病毒的生长特性，且负载的EGFP基因在禽源性细胞和哺乳动物细胞内均可表达。表明FAd V－9可构建成重组病毒载体用于禽类免疫或哺乳动物基因投递。Corredor J C等［23］构建了两种不同的复制型重组病毒，并分析了鸡群对重组病毒及其表达的外源基因产物、EGFP产生的抗体情况和鸡群粪便排毒情况。结果在接种重组病毒3周～7周后的鸡体内检测到了针对EGFP的抗体，在分别接种重组病毒和野生病毒的鸡体内均检测到了针对FAd V－9的抗体，并且抗体产生水平无显著性差异（P＞0.06）。接种重组病毒的鸡群未出现粪便排毒，而接种野生病毒的鸡群出现了粪便排毒。这些结果进一步支持了FAd V－9左末端复制非必需区适合插入外源基因但对病毒体内复制有重要作用的结论。

2.5 其他FAV载体

何秀苗［24］确定了FAd V江苏株基因组的一个复制非必需区（40 064 bp～42 284 bp），通过真核细胞内同源重组的方法获得了表达EGFP的重组FAd V，为研究FAd V江苏株的重组基因工程疫苗奠定了基础。Corredor J C等［25］先后对部分血清型的 FAd V（FAd V－2、FAd V－4、FAd V－8、FAd V－10）基因组左末端和右末端进行了序列分析，并与FAd V－1和FAd V－9的序列进行了比较。结果同种群内的FAd V（D群的FAd V－2和FAd V－9，C群的FAd V－4和FAd V－10）的核酸序列同源性和氨基酸序列的一致性很高，而不同群的各型FAd Vs之间存在不同程度的差异性。FAV基因组左末端和右末端的基因排列和ORFs的位置较高的保守性暗示了可能具有相似的基因功能。

综上所述，许多抗原基因已成功克隆到FAd V载体并有效表达，动物试验也证实重组FAd V能诱导较高水平的抗体，攻毒保护效果良好，并具有很好的安全性，因此，FAd V可作为基因工程重组疫苗的候选载体。

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