慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞Toll样受体4的变化及其与IL-6的关系

阎双缓 唐亚芳 陈翠英 王素平 宋海燕 耿建章 刘玉珍 戴二黑 卢建华

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是连接天然免疫及获得性免疫系统的重要桥梁［1］，其中TLR4主要表达在巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞及内皮细胞上，它识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)而引起机体特异性免疫反应。本研究以HBV携带者和慢性乙型肝炎患者(CHB)为对象，观察其外周血单核细胞表面TLR4受体表达水平，探讨TLR4在慢性乙型肝炎中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年2月至2011年2月石家庄市第五医院门诊及住院慢性HBV感染者共95例，其中HBV携带者30例(HBV携带组)，其中男19例，女11例;年龄19～69岁;CHB患者65例(CHB患者组)，男42例，女23例;年龄35～76岁。诊断符合2000年西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准［2］。排除其他HAV、HCV、HDV、HEV或HIV的合并感染及肝硬化、肝癌等失代偿肝病患者，近3个月未用过抗病毒药物及糖皮质激素等影响免疫功能的药物。对照组为健康成人30例，其中男18例，女12例;年龄22～66岁。3组一般资料具有均衡性。

1.2 检测方法

1.2.1 流式细胞仪检测外周血单核细胞TLR4:取EDTA抗凝血细胞悬液100 μl，分别加入 APC-anti-CD14单抗10 μl和 PE-anti-TLR4单抗 10 μl，室温放置 30 min，加入红细胞裂解液2 ml，避光静置 15 min，离心，1 000 μl PBS 液震荡洗涤 2 次，不加抗体设置阴性对照。离心弃去保存液，所得细胞以PBS液调整浓度至2×109/L，将标本置于流式细胞仪上，以APC-anti-CD14阳性设门，共获取门内10 000个单核细胞。经Cellquest统计软件分析，获取直方图，以平均免疫荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)表示TLR4的表达强度。

1.2.2 ELISA法检测血清IL-6水平:无菌采集静脉血5 ml，常规离心后取上清液，－80℃冰箱保存，待测。ELISA试剂盒是晶美生物有限公司分装的美国Genzyme公司产品。

1.3 统计学分析计量资料以表示，采用单因素方差分析和Scheffe检验及线性相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血单核细胞TLR4的表达水平 CHB患者组与对照组及HBV携带组比较，TLR4水平均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。HBV携带组与对照组比较，TLR4水平差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 血清IL-6水平 对照组、HBV携带组及CHB患者组外周血IL-6水平依次升高，3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05或 ＜0.01)。见表 1。

表1 3组病例外周血单核细胞TLR4与血清IL-6水平±s

表1 3组病例外周血单核细胞TLR4与血清IL-6水平±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与 HBV 携带组比较，△P ＜0.05

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2.3 外周血单核细胞TLR4的表达水平与血清IL-6水平的关系 HBV携带组外周血单核细胞TLR4表达水平与血清IL-6表达水平无相关性(r=－0.775，P=0.375);CHB患者组外周血单核细胞TLR4表达水平与血清IL-6水平呈现显著正相关(r=0.674，P＜0.01)。

3 讨论

免疫介导的肝损伤是多种慢性肝病的主要发病机制，TLRs信号系统可能在肝细胞损伤中起重要作用。其中TLR4的识别谱较广，生物学作用广泛，在乙型肝炎发病中的作用是一个值得探讨的问题［3］。

我们的研究结果发现，CHB患者外周血单核细胞TLR4水平高于健康人，且外周血单核细胞TLR4表达水平与血清IL-6水平存在密切关系，与尉秀清等［4］研究结果一致。目前关于TLR4表达的调控机制研究还比较少。内毒素是TLR4最重要的配体，体内内毒素等刺激信号以及IL-6高水平的表达可导致外周血单核细胞TLR4高水平的表达［4，5］。内毒素血症在乙型肝炎中的意义日益受到重视［6，7］，在CHB患者体内存在内毒素、凋亡细胞等TLR4刺激信号［8，9］，有可能导致外周血单核细胞对上述刺激信号产生过度反应，以及单核细胞IL-6高水平表达。IL-6可以通过多种信号通路导致肝细胞的凋亡和坏死，在慢性乙型肝炎血清IL-6的水平与病情进展有关，与肝脏炎症程度相关［10，11］。总之，CHB患者外周血单核细胞TLR4表达水平与血清IL-6表达水平可以互相影响，呈现正相关，从而在CHB发病中发挥一定作用。

研究亦发现，HBV携带者与正常人外周血单核细胞TLR4水平无明显差异，HBV携带者IL-6水平高于正常人，CHB患者IL-6水平高于HBV携带者，与田华［12］的研究结果一致。表明IL-6水平与病毒复制有关，更与肝细胞受损的程度有关。慢性HBV携带者IL-6水平升高，但不足以诱发大量TLR4产生，这也正是此类患者肝功能保持相对稳定的原因。

1 Medzhitov R，Preston-Hurlburt，Janeway CA.A human homologuw of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity.Nature，1997，388:384-397.

2 中华医学会肝病学分会与感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南.中华内科杂志，2006，45:162-170.

3 Iwasaki A，Medzhitov R.Toll-like receptor control of the adaptive immune responsies.Nat Immunol，2004，5:987-995.

4 尉秀清，郭云蔚，文卓夫，等.慢性重型乙型肝炎患者外周血单核细胞Toll样受体4的变化及其与IL-6的关系.中国病理生理杂志，2007，23:1563-1565.

5 Tamandl D，Bahrami M，Wessner B，et al.Modulation of toll-like receptor 4 expression on human monocytes by tumor necrosis factor and interleukin–6 tumor necrosis factor evokes lipopolysaccharide hyporesponsiveness whereas interleukin-6 enhances lipopolysaccharide activity.Shock，2003，20:224-229.

6 韩德五主编.肠源性内毒素血症与肝病.第1版.北京:中国科技出版社，2004.868-869.

7 李红，韩德五，张素美，等.乙型肝炎患者肠源性内毒素血症、高组胺血症与细胞免疫功能之间的关系.中国病理生理杂志，2006，22:559-562.

8 Lucas M，Stuart LM，savill J，et al.Apoptotis cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion.J Immunol，2003，171:2610-2615.

9 Sozinov AS.Systemic endotoxemia during chronic viral hepatitis.Bull Exp Biol Med，2002，133:153-155.

10 张伟英，杨利华，卓凌，等.慢性乙型肝炎患者血清TNF、IL-6、IL-10水平及其临床意义.国际检验医学杂志，2010，31:595-596.

11 陈瑞烈，王文锋，周震，等.重型乙型肝炎血清IL-1、IL-6和TNF-α水平的变化研究.临床肝胆病杂志，2005，21:273-274.

12 田华.乙肝病毒感染者血清3种细胞因子水平及其临床意义.检验医学与临床，2009，1:136-137.