Ezrin在胃癌组织中的表达及与P-gp、GST-π、LRP的关系

张文军 孙利梅 杨洪颖 左燕红 李茂恒 屈志钢

胃癌细胞具有较强的多药耐药性(multidrugs resistance，MDR)，这是导致胃癌综合治疗效果不佳的重要原因［1，2］。迄今为止，已发现有多种MDR相关蛋白质与胃癌MDR有关，但这些蛋白质都不能全面解释胃癌MDR现象，寻找新的与胃癌MDR相关的因子对探讨MDR机制、寻找MDR逆转靶点有重要意义。埃兹(Ezrin)基因是新近发现的与许多恶性肿瘤关系密切的新基因，可影响多种恶性肿瘤的侵袭和转移，在胃癌中也发挥重要作用［3－5］。研究显示，Ezrin蛋白还与肿瘤MDR有关，但Ezrin蛋白是否与胃癌MDR有关及其作用的机制尚未见报道。故本研究检测了Ezrin蛋白和与肿瘤MDR关系密切的P-gp、GST-π、LRP在胃癌中的表达，并对其关系和意义进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2006年10月至2009年10月在我院手术并经病理证实的胃癌患者的石蜡标本52例，其中36例有癌旁组织石蜡标本。所有患者均为初诊手术，肿瘤均为原发性胃癌，术前均未接受任何治疗。其中男38例，女14例;年龄29～75岁，平均年龄(57±10)岁。兔抗人Ezrin、LRP多克隆抗体、鼠抗人P-gp、GST-π单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术公司。

1.2 免疫组化染色(SP 法)测定 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP 蛋白表达 石蜡包埋标本4 μm连续切片后进行HE和免疫组化染色。切片脱蜡水化，3%过氧化氢孵育、蒸馏水冲洗，以PBS浸泡后进行抗原修复。以下严格按试剂盒说明操作:工作液封闭、加入一抗、孵育并冲洗后依次加二抗工作液、辣根酶标记链酶卵白素工作液。DAB显色，苏木素复染，脱水，中性树脂封片。

1.3 免疫组化结果判定 染色结果由两位病理学医师进行双盲阅片判断结果。每张切片随机取5个高倍视野(×400)，每视野均计数100个细胞，计算细胞的阳性率。Ezrin、P-gp、GST-π、LRP主要表达在细胞膜和细胞浆内，以出现黄色或棕黄色颗粒为染色阳性。记分标准:细胞内无阳性表达为(－)，＜50%细胞阳性表达为(+)，≥50%细胞阳性表达为(++)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 15.0统计软件，计数资料采用χ2检验，各因子间的关系采用Spearman相关分析并计算相关系数，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌和癌旁组织中Ezrin、P-gp、GST-π、LRP蛋白表达情况52例胃癌组织中 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP阳性表达率分别为77.8%、62.2%、73.3%、71.1%;癌旁组织 4 种蛋白表达阳性率分别为 26.7%、77.8%、35.6%、37.8%。经比较，Ezrin、P-gp、GST-π、LRP在胃癌组织中的表达均较癌旁组织增强(P＜0.05)。见表 1、图 1。

表1 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP在胃癌和癌旁组织中的表达 例

图1 胃癌组织Ezrin、P-gp、GST-π、LRP的表达(SP×200)

2.2 胃癌和癌旁组织中Ezrin、P-gp、GST-π、LRP蛋白表达的关系 Spearman相关分析结果显示，胃癌组织中Ezrin与P-gp表达存在正相关关系(r=0.3385，P=0.0141)，Ezrin与 LRP 表达存在正相关关系(r=0.3072，P=0.0267)，Ezrin 与 GST-π表达无明显相关关系(r=0.2449，P=0.0801);P-gp与 LRP表达存在正相关关系(r=0.2986，P=0.0315)，P-gp 与 GST-π、GST-π与LRP之间表达均无明显相关关系(r=0.2275，P=0.1048;r=0.1668，P=0.2373)。

3 讨论

胃癌是我国病死率最高的恶性肿瘤，该病进展快、预后差，总体5年生存率不超过40%。化疗是胃癌的重要治疗手段之一，但由于胃癌细胞具有较强的多药耐药性(MDR)［1，2］，造成化疗效果差，肿瘤易于复发、转移。迄今关于肿瘤MDR的研究已近40年，发现了多种与MDR有关的蛋白质，逆转MDR的药物也已开始应用，但一直未能发现在胃癌细胞中起关键作用的蛋白质。因此，寻找新的影响胃癌MDR的蛋白质对探讨胃癌MDR机制、确定MDR逆转靶点有重要意义。Ezrin蛋白在细胞的生长过程中发挥重要作用，并且具有调节细胞信号转导、粘附状态等功能［6］，在包括胃癌在内的多种肿瘤中存在过表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关［2－4］。本结果显示，Ezrin蛋白在胃癌组织中表达高于癌旁组织，说明Ezrin蛋白表达与肿瘤发生、进展有关，与其他报道结果符合。近年来还发现，Ezrin蛋白还与肿瘤的 MDR有密切的关系［5］，抑制 Ezrin蛋白对肿瘤的MDR特性有逆转作用。因此，本研究进一步检测了与胃癌MDR关系密切的P-gp、GST-π、LRP在胃癌组织中的表达，并分析了它们与胃癌MDR的关系。

P-gp是目前研究最多的与MDR相关的蛋白质，它定位于肿瘤细胞膜上，可以通过“药泵”作用把化疗药物从细胞内泵出，导致肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗［6］。GST-π则可以通过解毒作用把对细胞有杀伤作用的化疗药物水解为无害物质，造成肿瘤化疗效果减弱［7］。LRP具有与P-gp类似的作用，该蛋白激活时可以阻止药物进入细胞核，也可以把进入核内的药物泵出核外，并储存于细胞质的囊泡中，最终通过胞吐作用排出细胞外，从而导致 MDR［8］。本研究显示，P-gp、GST-π、LRP 在胃癌组织中的表达均较癌旁组织增强，说明胃癌细胞具有较强的MDR特性，对化疗药物的敏感性差。分析Ezrin蛋白与P-gp、GST-π、LRP 的结果显示，Ezrin 蛋白与 P-gp、LRP 均存在正相关关系，说明在胃癌MDR中，Ezrin蛋白可能通过影响P-gp、LRP的表达而参与胃癌MDR;而Ezrin蛋白与GST-π表达之间并未发现明显相关，说明在导致胃癌MDR的多种机制中，Ezrin蛋白可能仅与其中部分机制有关。这些结果仅处于现象观察阶段，具体机制尚待进一步研究予以阐明。

本研究初步证实了Ezrin蛋白在胃癌组织中表达增高，它可能通过影响P-gp、LRP的表达而参与胃癌MDR。但我们也发现Ezrin蛋白仅与部分胃癌MDR蛋白有关，关于Ezrin蛋白参与胃癌MDR的机制还不明确，有待于进一步深入研究。

1 Wang CH，Zheng WB，Qiang O，et al.Effects of non-cytotoxic drugs on the growth of multidrug-resistance human gastric carcinoma cell line.J Dig Dis，2009，10:91-98.

2 Tan J，Zhang C，Qian J.Expression and significance of Six1 and Ezrin in cervical cancer tissue.Tumour Biol，2011，32:1241-1247.

3 Zhao J，Zhang X，Xin Y.Up-regulated expression of Ezrin and c-Met proteins are related to the metastasis and prognosis of gastric carcinomas.Histol Histopathol，2011，26:1111-1120.

4 Bernaba BN，Vogiatzis PI，Binder SW，et al.Potentially useful markers for desmoplastic melanoma:an analysis of KBA.62，p-AKT，and ezrin.Am J Dermatopathol，2011，33:333-337.

5 He ZY，Wen H，Shi CB，et al.Up-regulation of hnRNP A1，Ezrin，tubulin β-2C and Annexin A1 in sentinel lymph nodes of colorectal cancer.World J Gastroenterol，2010，16:4670-4676.

6 Schrickx JA，Fink-Gremmels J.A porcine lymphocyte model for P-gp inhibition studies.J Vet Pharmacol Ther，2011，34:499-501.

7 Thévenin AF，Zony CL，Bahnson BJ，et al.GST pi modulates JNK activity through a direct interaction with JNK substrate，ATF2.Protein Sci，2011，20:834-848.

8 Wang J，Zhang J，Zhang L，et al.Expression of P-gp，MRP，LRP，GST-π and TopoIIα and intrinsic resistance in human lung cancer cell lines.Oncol Rep，2011，26:1081-1089.