骨折后早期血肿与骨折愈合机制研究进展

张里程 综述，唐佩福 审校

骨折后早期血肿与骨折愈合机制研究进展

张里程 综述，唐佩福 审校

骨折愈合;血肿;免疫细胞;细胞因子

骨折愈合是一个涉及多种细胞及细胞因子协同作用的复杂过程［1］，根据组织学特点分为炎性反应期、软骨痂形成期、硬骨痂形成期及骨痂重塑期。骨折后早期血肿标志炎性反应期开始，其内含多种免疫细胞、骨髓基质细胞及相关细胞因子，对于骨折愈合至关重要［2－5］。研究表明清除骨折后血肿将导致骨折延迟愈合或不愈合，而皮下输注骨折后血肿则具有成骨作用［3，4］。尽管血肿对于骨折愈合的重要性不言而喻，但其详细调节机制目前仍不清晰。因此，深入解析血肿及其内细胞、细胞因子体液成分在骨折愈合中的作用，对促进骨折愈合、防止延迟愈合或不愈合等并发症有重要意义。笔者就骨折后早期血肿内各种组分与骨折愈合关系及相关机制研究进展进行综述。

1 骨折后早期血肿的意义

骨折发生时，不但骨、骨膜及周围软组织结构被破坏，同时还损伤骨折处血管造成出血，导致富含外周血细胞、免疫细胞及干细胞的血肿形成。尽管早在20世纪初，组织学研究证明了骨折后血肿对于保障骨折愈合的重要性，然而在临床工作中常常忽视其存在。在治疗开放骨折时，为减少感染风险，通常采取反复灌洗和清创;甚至闭合骨折也鲜有考虑血肿有骨折愈合作用，血肿常被清除。动物实验证实，骨折后第2天及第4天时清除骨折血肿或者骨折后第1天及第2天进行彻底清创将导致骨折延迟愈合或者不愈合，并且研究还发现，骨折后血肿诱导成骨能力随着时间延长而增强，骨折后第2天血肿仅能在邻近骨膜的协助下产生成骨作用，而骨折后第4天血肿输注到肌肉组织中具有直接成骨作用［2，3］。上述研究提示骨折后第2天血肿内含有的成骨细胞因子，可能是其促进骨膜成骨原因，这一点也通过骨折后血肿上清液的骨诱导实验得以证实［6，7］;而骨折后第4天血肿内不仅含有细胞因子，而且含有成骨潜能干细胞;这一点在Oe等［8，9］研究中得到直接证实，研究者在成熟血肿内分离出具有多分化潜能的间充质干细胞，并且在特异性细胞分化诱导因子作用下，定向分化为成骨及成软骨细胞。该研究结果也提示在较成熟的血肿期，骨折愈合过程已经启动，并且发挥着重要作用。

2 血肿内细胞成分与骨折愈合

2.1 免疫细胞成分与骨折愈合 早在20世纪70年代，研究者就发现外周血白细胞培养液能调节破骨细胞吸收活性，提示骨骼系统与免疫系统存在联系。随后越来越多研究证实，骨细胞与免疫细胞都起源于骨髓，从起始、成熟到活化，存在许多共同调节因子、受体及信号转导通路，而且巨噬细胞和破骨细胞来源于同一祖细胞，由此人们更加确信骨细胞与免疫细胞之间联系，并提出了骨免疫学概念［10］。研究证明骨细胞与免疫细胞之间存在复杂的调控关系网:其中T细胞对破骨细胞调节呈双向性，比如激活的T细胞通过表达RANKL促进破骨细胞形成［6］，辅助性T细胞Th17细胞通过表达 IL －17 刺激破骨细胞分化［11］，另外，CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞还可以通过分泌 TGF－b、IL－4、IL－10抑制破骨细胞形成［12］。T细胞分泌的细胞因子同样调节成骨细胞分化及功能，比如IL－4对成骨细胞具有趋化作用，而分泌的IFN－γ同样具有诱导成骨的作用［12，13］。因此，免疫系统及免疫细胞与骨代谢调节密不可分。

从免疫学观点来看，骨折后血肿形成预示着炎性反应的开始，而适当的炎性反应对骨折愈合至关重要［14，15］。研究发现，创伤过程会给免疫系统带来影响，骨折后早期(1～4 h)血肿内细胞成分就会发生改变，尤其是免疫细胞成分开始增加［7］。在骨折后血肿起始阶段(24 h)，大量中性粒细胞趋化至损伤区域，以其强大的噬菌能力，成为预防感染的保障!实验表明这一时期血肿内粒细胞/单核细胞对淋巴细胞的比值能达到外周血中两倍［7］。在血肿形成的48～96 h，迎来巨噬细胞迁徙的高峰，这一细胞组分对骨折愈合非常重要，除了能吞噬消化组织细胞碎片外，同时还能分泌多种细胞因子，包括 TNF －a、IL－1、IL－6、IL －8、IL －12、TGF －b、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子－1等，刺激成纤维细胞增殖分化、胶原蛋白及血管生成［16］。而且研究证实，巨噬细胞剔除将导致组织愈合延迟，而补充巨噬细胞则能促进胶原合成及组织修复［17］。

与巨噬细胞类似，剔除全部T淋巴细胞也会抑制组织愈合［18］。此外研究发现，细胞毒性T淋巴细胞对骨折愈合具有负性调节作用，在骨折正常愈合时，血肿内细胞毒性T淋巴细胞成分持续下降，60 h达到最低值;而在骨折延迟愈合的血肿内，细胞毒性T淋巴细胞比例增高明显［19］。而辅助性T淋巴细胞对骨折愈合具有促进作用，在骨折初期(24～60 h)的血肿内比例增高明显［20］。因此，对T淋巴细胞选择性剔除也会得到不同的结果:比如选择性剔除CD8+T淋巴细胞(其主要功能亚群是细胞毒性T细胞)能促进组织愈合，但单独剔除活化的CD4+T淋巴细胞(辅助性T淋巴细胞)则导致愈合的延迟［16，21］。

2.2 干细胞成分与骨折愈合 间充质干细胞是一类具有多向分化潜能细胞，在骨折愈合过程具有重要作用。而且研究人员发现，在骨折6～72 h血肿内，具有调节间充质干细胞定向分化为成骨细胞能力的转录因子RUNX2，以及成骨细胞分化晚期标记基因SPP1表达明显增加［1］。另外，研究者还在相对成熟血肿内分离出具有多分化潜能的间充质干细胞［8］，均提示血肿内间充质干细胞成分对于骨折愈合的重要意义。

血肿内间充质干细胞来源于两个部分:一是骨折过程中损伤破坏的骨髓及骨膜;二是炎性反应期释放的促炎性细胞因子或生长因子对循环血中干细胞的趋化作用［4］。最新研究发现，在趋化间充质干细胞至骨折损伤区域过程中，基质细胞衍生因子SDF－1及其G蛋白偶联受体CXCR－4形成的 SDF－1/CXCR －4调节轴具有核心调控作用［22，23］。在损伤区域血肿内发现SDF－1表达增加，尤其是在血肿临近骨膜部位。研究还证实在软骨内成骨过程中，SDF－1能特异性趋化CXCR－4表达阳性间充质干细胞进入损失区域。另外，通过给予抗SDF－1抗体，或者外源性SDF－1、CXCR－4蛋白，能够抑制间充质干细胞的趋化，进而影响骨折愈合，该研究不仅进一步验证了SDF－1/CXCR－4调节轴的重要性，而且也间接证明了间充质干细胞对于骨折愈合的意义。

此外研究发现，低氧诱导因子HIF－1能通过调节SDF－1表达促进间充质干细胞的趋化作用［24］。另外，在间充质干细胞定向分化为成骨细胞过程中，sFRP1(secreted frizzled related protein1)发挥重要负性调节作用［25］，主要通过canonical－Wnt信号通路促进间充质干细胞向成骨细胞分化，促进骨折愈合。目前sFRP1已成为促进骨折愈合新的治疗靶点。

3 血肿内细胞因子成分与骨折愈合

近10年来，越来越多研究开始关注细胞因子及生长因子在骨折愈合中发挥的作用，多达50种细胞因子、血管生长因子、蛋白酶及形态发生蛋白被证实与骨折愈合过程有关，然而，关于骨折局部血肿内细胞因子、生长因子表达及调节骨折愈合的详细机制仍不清楚。

3.1 血管生长因子与骨折愈合 对血肿上清液进行分析发现pH值减低、磷酸盐、碱性磷酸酶以及乳酸盐水平增高，证实骨折后早期血肿内存在缺氧表现［1，26］。而缺氧能诱导一系列血管生长因子表达，其中HIF－1是低氧状态下血管发生的核心调控因子，在血肿形成24～36 h后表达增加，并通过调节其他生长因子表达，促进血管形成。研究发现:低氧状态下，VEGF mRNA及VEGF受体mRNA表达水平随着HIF－1a表达增高而增高，呈明显的相关性［27，28］。而 VEGF是最直接的血管内皮细胞促分裂素，以旁分泌或自分泌形式产生后，与其受体结合，通过促进骨源性内皮前体细胞募集、迁徙、活化与增殖，促进血管形成［28，29］。因此，学者们认为HIF－1a主要通过促进VEGF表达刺激血管发生、形成。此外，HIF－1能在转录水平上影响HMOX1(血红蛋白加氧酶1)，GLUT1(葡萄糖载体蛋白1)表达，而这也是HIF－1a调节血管生成的另一条通路［20］。

另外，研究发现，骨折24～36 h后，血肿内内皮细胞标记物vWF表达开始增加，也提示血肿内新生血管形成启动［20］。而且骨折愈合延迟时，vWF、Ang1、Ang2、VEGF、CYR61、FGF2、MMP2、TIMP1 等血管生长因子表达均会降低［29］。

3.2 炎性因子与骨折愈合 血肿的形成预示着炎性反应开始，也标志着骨折愈合启动。炎性细胞首当其冲，进入骨折血肿内，并通过分泌细胞因子和其他炎性介质，介导炎性反应作用。根据细胞因子的特性可分为:促炎细胞因子和抗炎细胞因子;其中IL－1，IL－6，MCSF及TNFa是炎性反应初期表达增加的促炎细胞因子，并且在趋化内源性基质干细胞、内皮前体细胞及血管再生过程中发挥重要作用［20］。

通过检测不同时期血肿内细胞因子组分，发现IL－1，IL－6，IL－8，MCSF及TNFa均随着时间延长而在骨折血肿内含量上升:IL－1b在4 h内即达到峰值，IL－6在12 h内达到最高，MCSF及TNFa均在4～24 h左右达到峰值，而IL－8则在48 h后达最高，其中IL－1b与MCSF在损伤后1～4 h增加最为迅速［20］。然而在炎性反应开始的同时，具有抑制炎性反应作用的细胞因子也开始表达。在血肿形成最初4 h内，抗炎细胞因子TGF－β表达开始增加，直到2～8周时达到峰值，其表达一直贯穿于骨折愈合的早期阶段［13，20］。在血肿形成24～36 h内，抗炎性细胞因子IL－10表达水平明显增高，并且与HIF－1a表达呈明显的相关性［20］。并最终在血肿形成36 h后，IL－10、TGF－β等抗炎性细胞因子起主导作用，控制和消除组织炎性反应，并促进炎性反应期向细胞增殖期转变。急性炎性反应期一般在24 h左右达到高峰，并且在7 d内结束。如果促炎性细胞因子过表达(TNFα、IL－1β等)或者促炎性细胞因子/抗炎性细胞因子表达失衡，将导致炎性反应期延长及血管化进程的抑制，最终会影响骨折愈合过程［19］。

尽管骨折后早期血肿对于骨折愈合的重要意义已经证实，但是血肿内炎性反应、免疫细胞及其相关细胞因子对于骨折愈合的详细机制仍未得到充分解析。炎性反应或炎性因子对于骨折愈合不仅仅是正性调节关系，延长的炎性反应或炎性因子过表达将给骨折愈合及血管化带来负面影响。因此继续深入解析骨折后早期血肿特性，并对各种免疫细胞及炎性因子的正性、负性调节骨折愈合作用进行区分与解读，将有助于研究及制定新的骨折治疗策略，并指导临床工作中对骨折后早期血肿处理，最终对促进骨折愈合、防止延迟愈合或不愈合等并发症有重要意义。

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R274.1

张里程，男，1982年出生。博士研究生，医师。主要从事创伤骨科基础与临床工作。

100853 北京，解放军总医院骨科

唐佩福，E －mail:pftang301@126.com

(2012－03－01收稿 2012－08－11修回)

(责任编辑 武建虎)

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