EMT与器官纤维化发生关系的研究进展

王 江 综述，陈东风 审校

1.中国人民解放军第三军医大学学员旅三队，重庆400038;2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科

1 EMT 的概念

EMT即上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition)是Greenberg和Hay在1982年首次提出的概念，他们在凝胶中培养的晶状体上皮细胞失去了极性，转变成为具有伪足的间质样细胞［1］。目前认为EMT在胚胎的形成与发育、肿瘤的侵袭与转移，以及组织愈合和器官纤维化等生理和病理过程中起着重要的作用［2］。

EMT不仅有细胞表型的改变，还包括细胞标志的改变，主要表现为失去上皮细胞标志，获得间质细胞标志，包括上皮细胞极性消失，E-钙黏蛋白、角蛋白、ZO-1蛋白水平的下调，间质细胞的标志FSP-1/S100A4、α-SMA、波形蛋白表达的上调。此外，发生EMT的细胞还可使纤维连接蛋白、Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、金属基质蛋白酶的表达增加［3-4］。

2 EMT的发生机制

多种生长因子、细胞因子、激素都可以诱导或促进EMT的发生，比如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)等。近年来的研究发现某些microRNA也可以诱导EMT的发生，其中TGF-β是最为重要的诱导分子，在EMT所参与的胚胎发育、肿瘤转移、器官纤维化中均起着重要的作用［5-7］。Meng等研究发现足糖萼蛋白(podocalyxin)可以上调TGF-β诱导EMT发生的能力。低水平的足糖萼蛋白将影响TGF-β诱导的E-钙黏蛋白的减少和波形蛋白的增加［8］。值得注意的是TGF-β具有一定的抗炎作用，如果完全阻止TGF-β的表达，小鼠将会死于炎症［9］。

2.1 TGF-β/Smad TGF-β 超家族由 TGF-β 亚型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)、激活素、骨桥蛋白(BMP)组成，其中TGF-β1在哺乳动物中的含量最高，也是最先发现的，它可以通过TGF-β/Smad通路诱导EMT的发生。Smad家族主要包括3种类型，第一种为受体调节型(R-Smad)，包括 Smad1、2、3、5、8;第二种为共同通道型(Co-Smad)，包括Smad4;第三种为抑制型(Ⅰ-Smads)，包括 Smad6和 Smad7。其中 R-Smad和 Co-Smad具有两段同源序列，它们在TGF-β/Smad通路中起转录激活作用。Ⅰ-Smads具有抑制TGF-β/Smad通路的作用［10］。

TGF-β1具有3种跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶受体，即 TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、TGF-βRⅢ，TGF-β1 首先与位于TGF-βRⅡ的胞外段相结合，使位于胞内侧的TGF-βRⅠ发生磷酸化而被激活。活化的TGF-βRⅠ然后激活下游的Smad2和Smad3，然后再与Smad4相结合，形成Smad复合体进入细胞核中，与特定的DNA序列相结合，从而调控转录［3］。

2.2 Wnt/β-catenin Wnt/β-连环蛋白是 EMT 发生的另外的一条重要的信号通路。细胞外的Wnt与细胞膜上的Fz受体结合，将信号传递到细胞内，导致GSK-3β表达的抑制，引起细胞内的β-catenin的集聚，最终进入细胞核中可与转录因子LEF/TCF相结合，激活编码纤维连接蛋白、波形蛋白、金属蛋白酶、Snail家族蛋白等的基因，发生 EMT。此外，IGF-Ⅱ、Ras、ILK均可以使β-catenin在细胞质中保持一定的水平，有利于EMT的发生。如果GSK-3β在没有被抑制的情况下，可使β-catenin的磷酸化被抑制，β-catenin将与E-钙黏蛋白结合，介导细胞间的黏附［11-12］。

除了以上两条途径，EMT的发生还有其他的信号通路的参与，例如Notch、ERK1/2、RhoA等，各通路之间又有相互的联系，共同构成一个信号网络系统，参与EMT的发生。

3 EMT参与纤维化的发生

纤维化是许多疾病的一个共同的病理过程，它的形成可以大概分为三个过程:①受损的上皮细胞释放细胞因子，引起炎症细胞在受损部位的聚集;②聚集的炎症细胞分泌细胞因子，引起上皮细胞的损害，成纤维细胞的增生和间质蛋白的产生;③炎症减退，受损器官纤维化的形成。随着对纤维化机制研究的深入，近年来发现EMT在器官纤维化的形成中起着重要的作用。目前发现肾、肝、肺、眼等器官的纤维化都有EMT 的发生［3，13］。

3.1 肾纤维化 肾间质纤维化是几乎所有的慢性肾脏疾病(CKD)发展到终末期的共同通路，其主要表现为细胞间质的增多，引起肾小管的损伤。肾间质纤维化的主要特征为细胞间黏附力降低，α-SMA和FSP1的表达，肌动蛋白重组，肾小管基底膜的破坏，细胞转移和侵袭力的提高［14］。

Strutz等［15］最早报道了EMT存在于肾纤维化中，他发现经毒物刺激后肾小管的上皮细胞可以表达FSP1，而FSP1只在成纤维细胞上表达，因此认为肾小管的上皮细胞发生了EMT，转变成了间质细胞。Iwano等［16］利用单侧输尿管梗阻(UUO)模型研究发现在肾间质纤维化中，新形成的成纤维细胞中约36%来源于EMT，约14% ～15%来源于骨髓干细胞，其余来自本身组织中的成纤维细胞的增殖。TGF-β也可引起细胞凋亡的发生，主要导致足细胞凋亡，可引起肾小球纤维化，血管球和管周的微血管损害和肾小管萎缩［9］。最近有学者研究发现肾小球的足细胞在纤维化中也有EMT的发生，引起足细胞的功能障碍，导致肾小球滤过功能障碍，产生蛋白尿［20］。在临床中，EMT细胞标记的出现总是先于组织病理的改变，并且它们的敏感性较高，因此，这些标志可以作为肾纤维化的一个筛查指标，也可用于抗纤维化药物疗效的评价。目前，临床拟将波形蛋白和β-连环蛋白的联合检查作为肾小管损害的检测指标，但其可靠性和可行性还在进行评价之中［18］。在对糖尿病肾病、狼疮性肾病、IgA肾病等患者进行肾组织活检中发现，其肾小管有FSP1、波形蛋白等间质细胞标志的表达，且其与肾功能的下降具有一定的关联性［14］。

3.2 肝纤维化 持续的慢性肝损伤会引起大量的细胞外基质(大多为Ⅰ型胶原蛋白)的沉积，发生纤维化。如不及时对纤维化进行干预，最终会导致肝硬化的发生，造成肝脏的不可逆损伤。以往研究认为肝星状细胞(HSC)在肝纤维化过程中起着关键的作用［19］。但许多学者针对引起纤维化的HSC的激活和胶原蛋白沉积的机制进行抗纤维化药物的研究，并没有研制出具有特效的终止肝纤维化向肝硬化进展和逆转肝纤维化的药物。

近年来，不少学者提出EMT可能是肝纤维化另外一条重要的机制。Kaimori等［20］将小鼠的离体肝细胞进行培养，观察到上皮细胞基因的表达下调，间质细胞基因的表达得到上调，α-SMA、FSP1、胶原蛋白等间质细胞的标志表达增加，并且它们的转移能力也增强，说明肝细胞可以发生 EMT。Zeisberg等［21］利用 CC l4刺激转基因的小鼠(这类小鼠的肝细胞可以表达β-半乳糖苷酶)来制作肝纤维化模型，结果发现在纤维化区域有大量FSP1阳性的细胞沉积，且这些细胞中有45%的细胞也表达β-半乳糖苷酶，这有力地说明了EMT为肝纤维化的机制之一。最近，有研究认为HSC的来源也与EMT有关，并且HSC在一定条件下可以转化为肌成纤维细胞和肝细胞［2］。此外，Omenetti等［22］发现EMT在胆管纤维化中也起着重要的作用。他还在PBC的病人的肝脏切片中观察到有间质细胞标志(FSP1)的表达。

4 EMT的逆转

临床上一直缺乏对纤维化有效的治疗措施，对纤维化EMT机制的逐渐深入研究，为纤维化的治疗提供了一条新思路。EMT的调控是一个较为复杂的网络系统，理论上只要阻断EMT发生的通路，就可以有效地防止或逆转纤维化的进程。目前研究发现骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、肝细胞生长因子(HGF)、Smad7等都具有逆转EMT的作用［23-24］。

4.1 BMP-7逆转EMT BMP-7属于TGFβ超家族的一员。Zeisberg等［21］将 rhBMP7和 TGF-β1一并加入肝细胞培养液中进行培养，发现肝细胞并未发生EMT。此外，在用CCl4注射小鼠制备肝纤维化模型前2周和注射CCL4后2周时分别注射rhBMP7，6周后进行肝脏切片进行观察，发现这两组发生纤维变性的区域都明显少于空白对照组。BMP-7抑制EMT的机制主要是通过与其ALK3/6受体相结合，激活Smad1、Smad5和Smad8，然后与Smad4形成复合体，竞争性抑制TGFβ1与其受体结合，从而抑制EMT的发生，增加E-钙黏蛋白的表达和恢复上皮细胞的表型［25］。

4.2 HGF逆转EMT HGF是一个重要的抗纤维化的因子，并在组织的修复和再生上具有重要的作用［24］。HGF主要是通过与其受体c-met相结合，下调TGFβ诱导EMT的作用。Yang等在研究发现HGF在离体和在体实验中都可阻止EMT的发生，使α-SMA的表达降低，保持细胞间的黏附性，防止细胞表型的转换［26］。

4.3 中医中药 Pan等［27］研究发现丹参在肾纤维化的治疗中起着重要作用，丹参缩酚酸(Sal B)是丹参中含量最为丰富的生物活性分子。研究发现Sal B对EMT的作用存在剂量效应关系，在体外试验中，小剂量的Sal B可以作用于TGFβ通路，阻止EMT的发生。随着剂量的增大，Sal B可以完全逆转EMT的过程，存在重要的治疗意义。

随着对EMT研究的深入，EMT在纤维化中的作用得到越来越多学者的支持。但是EMT的研究仍有不少难题，比如，目前还没有十分准确的方法来确定发生EMT细胞的来源。明确纤维化的机制，将对纤维化治疗药物的开发具有十分重要的意义。

［1］Greenburg G，Hay ED.Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express characteristics of migrating mesenchymal cells［J］.J Cell Biol，1982，95(1):333-339.

［2］Choi SS，Diehl AM.Epithelial-to-mesenchymal transitions in the liver［J］.Hepatology，2009，50(6):2007-2013.

［3］Guarino M，Tosoni A，Nebuloni M.Direct contribution of epithelium to organ fibrosis:epithelial-mesenchymal transition ［J］.Hum Pathol，2009，40(10):1365-1376.

［4］Zeisberg M，Neilson EG.Biomarkers for epit helial-mesenchymal transitions［J］.J Clin Invest，2009，119(6):1429-1437.

［5］Savagner P.Leaving the neighborhood:molecular mechanisms involved during epithelial-mesenebymal transition ［J］.Bioessays，2001，23(10):912-923.

［6］Strutz F，Zeisberg M，Ziyadeh FN，et al.Role of basic fibroblast growth factor-2 in epithelial-mesenchymal transformation ［J］.Kidney Int，2002，61(5):1714-1728.

［7］Savagner P.heaving the neighborhood:molecular mechanisms involved during epithelial-mesenchymal transition ［J］.Bioessays，2001，23(10):912-923.

［8］Meng X，Ezzati P，Wilkins JA.Requirement of Podocalyxin in TGFBeta Induced Epithelial Mesenchymal Transition ［J］.PLoS One，2011，6(4):e18715.

［9］Cho MH.Renal fibrosis ［J］.Korean J Pediatr，2010，53(7):735-740.

［10］Bottinger EP，Bitzer M.TGF-beta Signaling in Renal Disease［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(10):2600-2610.

［11］Nelson WJ，Nusse R.Convergence of Wnt，beta-catenin，and cadherin pathways［J］.Science，2004，303(5663):1483-1487.

［12］Kalluri R，Neilson EG.Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis ［J］.J Clin Invest，2003，112(12):1776-1784.

［13］Kuncio GS，Neilson EG，Haverly T.Mechanism of tubularinterstitial fibrosis［J］.Kidney Int，1991，39(3):550-556.

［14］Liu Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21(2):212-222.

［15］Strutz F，Okada H，Lo CW，et al.Identification and characterization of a fibroblast marker:FSP1 ［J］.J Cell Biol，1995，130(2):393-405.

［16］Iwano M，Plieth D，Danoff TM，et al.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis［J］.J Clin Invest，2002，110(3):341-350.

［17］Li Y，Kang YS，Dai C.Epithelial-to-mesenchymal transition is a potential pathway leading to podocyte dysfunction and proteinuria ［J］.Am J Pathol，2008，172(2):299-308.

［18］Galichon P，Hertig A.Epithelial to mesenchymal transition as a biomarker in renal fibrosis:are we ready for the bedside?［J］.Fibrogenesis Tissue Repair，2011，6(4):11-17.

［19］Parsons CJ，Takashima M，Rippe RA.Molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis［J］.J Gastroenterol Hepatol，2007，22(S1)，S79-S84.

［20］Kaimori A，Potter J，Kaimori JY，et al.Transforming growth factorbeta1 induces an epithelial-to-mesenchymal transition state in mouse hepatocytes invitro ［J］.J Biol Chem，2007，282(30):22089-22101.

［21］Zeisberg M，Yang C，Martino M，et al.Fibroblasts derive from hepatocytes in liver fibrosis via epithelial to mesenchymal transition［J］.J Biol Chem，2007，282(32):23337-23347.

［22］Omenetti A，Porrello A，Jung Y，et al.Hedgehog signaling regulates epithelial-mesenchymal transition during biliary fibrosis in rodents and humans［J］.J Clin Invest，2008，118(10):3331-3342.

［23］Liu Y.Renal fibrosis:New insights into the pathogenesis and therapeutics［J］.Kidney Int，2006，69(2):213-217.

［24］Stopa M，Benes V，Ansorge W，et al.Genomic locus and promoter region Smad7，an important antagonist of TGFβ signaling［J］.Mamm Genome，2000，11(2):169-176.

［25］Zeisberg M，Kalluri R.The role of epithelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosis［J］.J Mol Med，2004，82(3):175-181.

［26］Yang J，Liu Y.Blockage of Tubular Epithelial to Myofibroblast Transition by Hepatocyte Growth Factor Prevents Renal Interstitial Fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(1):96-107.

［27］Pan RH，Xie FY，Chen HM，et al.Salvianolic acid B reverses the epithelial-to-mesenchymal transition of HK-2 cells that is induced by transforming growth factor-β ［J］.Arch Pharm Res，2011，34(3):477-483.