DLC-1、FAK及p130Crk相关底物在卵巢上皮性癌中的表达及意义

任 芳，史惠蓉，陈志敏，樊冬梅，刘慧娜，纪 妹，韩丽萍

(郑州大学第一附属医院妇产科 河南郑州 450052)

卵巢癌是女性生殖器官3大恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤之首，5年生存率仅25%～30%，已成为威胁妇女生命和健康的主要原因。卵巢癌由于缺乏早期诊断方法，发现时多数已属晚期，且有约60%～70%患者在治疗中发生耐药和复发转移。因此，寻找能早期诊断及判断预后的相关因子，以及有效治疗靶点是目前卵巢癌研究的重点。肝癌缺失因子-1(deleted in liver cancer-1，DLC-1)［1，2］是一种肿瘤抑制基因，与细胞凋亡、肿瘤浸润转移关系密切。粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一类非受体型胞质蛋白酪氨酸激酶，分布在细胞粘着斑部位［3］。信号分子p130Crk相关底物(Crk-associated substrate 130 kDa，p130Cas)是一种高度磷酸化的蛋白质，在细胞的恶性转化、肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥着重要的作用［4，5］。本研究应用免疫组化技术检测DLC-1、FAK和p130Cas在正常卵巢组织及卵巢上皮性癌中的表达，分析3者在卵巢上皮性癌中表达之间的相关性及其与卵巢癌临床病理指标之间的关系，探讨DLC-1、FAK和p130Cas的检测对于卵巢上皮性癌早期诊断和预后分析存在的潜在价值。

1 临床资料与方法

1.1 临床资料 收集2006年至2008年郑州大学第一附属医院妇科手术存档蜡块，其中正常卵巢组织(因子宫肌瘤而行卵巢切除者)22例，卵巢上皮性癌62例。62例卵巢癌患者的年龄19～73岁，中位年龄50岁。所有标本均为初次诊断，术后经病理学诊断证实，患者术前均未经过放疗和化疗。

1.2 主要试剂 山羊抗人DLC-1多克隆抗体(ab21200，稀释浓度为1∶100)购自英国Abcam公司;鼠抗人FAK单克隆抗体(SC-1688，稀释浓度为1∶50)为美国Santa Cruz公司产品;p130Cas鼠抗人单克隆抗体购自美国Neomarkers公司;免疫组化SP、PV试剂盒及DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3 免疫组织化学方法 常规4 μm厚度连续切片、贴片、脱蜡。免疫组织化学染色按照试剂盒的操作步骤进行。所有切片染色均在相同条件下进行，每批染色均设阳性对照和阴性对照。结果判定:以胞浆内有黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。染色强度:无着色(0分);染色淡黄(1分);染色黄(2分);染色棕黄(3分)。阳性细胞数:阳性细胞数量的百分比≤5%(0分);5%＜阳性细胞数量的百分比≤25%(1分);25%＜阳性细胞数量的百分比≤50%(2分);阳性细胞数量的百分比＞50%(3分)。最终评分=染色强度×阳性细胞数。根据分值可将染色结果分为:阴性:0-1分;阳性:＞2分。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计数资料采用 χ2检验;相关性检验采用Spearmen等级相关分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌和正常卵巢组织中的表达情况 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌中的阳性表达率分别为54.8%、79.0%和87.1%;在正常卵巢组织中的阳性表达率分别为100%、27.3%和31.8%。DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌中的表达与正常卵巢组织相比，其差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 DLC-1和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌组织和正常卵巢组织中的表达

2.2 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达与临床病理特征间的关系 DLC-1蛋白的表达与卵巢癌的FIGO分期、有无腹水和淋巴结转移有关(P＜0.05)，与组织学类型、分化程度和年龄无关(P＞0.05)。FAK蛋白的表达与卵巢癌的分化程度、有无腹水和淋巴结转移相关(P＜0.05)。p130Cas蛋白的表达与卵巢癌的FIGO分期和有无淋巴结转移有关(P＜0.05)。见表2。

2.3 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌组织中表达的相关性 DLC-1与FAK蛋白表达呈负相关(r=－3.08，P=0.015)。DLC-1和p130Cas蛋白表达之间呈负相关(r=－0.330，P=0.006)。

表2 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白的表达与卵巢癌临床病理特征的关系

3 讨论

3.1 DLC-1在卵巢上皮性癌中的表达及其意义 肝癌缺失基因(DLC-1)是1998年采用再现差异分析法发现的一种新的抑癌基因，在人类多种肿瘤中呈低表达或表达缺失。DLC-1蛋白是RhoA和Cdc42特异性的GTP酶激动蛋白，参与基因转录、细胞周期调控及信号传导通路的调节，与细胞凋亡、肿瘤浸润转移及细胞骨架形成关系密切［6，7］。

Kim等［2］对肝癌细胞株的研究发现DLC-1的过表达可以抑制肿瘤细胞的移行。Peng等［8］研究发现，鼻咽癌中DLC-1的表达与肿瘤局部浸润的范围有关。而卵巢癌组织中的DLC-1表达情况报道很少。本研究发现，卵巢癌中DLC-1蛋白表达明显低于正常卵巢组织(P＜0.05)，表明DLC-1的低表达与卵巢癌的发生密切相关。在临床期别晚、有腹水、有淋巴结转移的卵巢癌患者中，DLC-1表达显著降低(P＜0.05)，表明DLC-1与卵巢癌的侵袭转移等生物学行为有直接关系。国外研究［9，10］发现肝癌和乳腺癌细胞系中DLC-1的肿瘤转移抑制作用，也从另一角度支持本研究的发现。

3.2 FAK在卵巢上皮性癌中的表达及其意义 粘着斑激酶(FAK)是一个多功能的非受体酪氨酸激酶，它在细胞间及细胞与细胞外基质粘附中起关键作用，在许多肿瘤组织中都有FAK表达增加。FAK激活后，介导整合素、FAK/Src等多条信号传导途径来参与细胞的分化、增生以及肿瘤的侵袭与转移等过程［11，12］。

Fujii等［13］发现，FAK在肝癌组织中呈过度表达;另外，Aalbers等［14］发现，在结直肠癌中FAK的高表达与肿瘤侵袭和转移有密切关系。本研究显示，卵巢癌中FAK蛋白的表达显著高于正常卵巢组织(P＜0.05)。在肿瘤分化程度低、有腹水、有淋巴结转移的卵巢癌患者中，FAK表达显著增高(P＜0.05)。表明高表达的FAK可能促进卵巢癌细胞的恶性增殖和转化，且与卵巢癌的浸润转移有关。

3.3 p130Cas在卵巢上皮性癌中的表达及其意义

p130Cas最初在癌基因V-src和V-crk转化的细胞中鉴定出来的一个高度磷酸化的蛋白质［4，5］。作为整合素通路中关键的信号分子，p130Cas不仅参与细胞黏附、迁移、存活和增生等一系列的生理过程，还在细胞恶性转化、肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥着重要的作用。

Wei等［4］发现p130Cas与肺癌细胞的抗失巢生长密切相关。Wendt等［5］发现在乳腺癌中，p130Cas表达的降低能逆转肿瘤细胞侵袭和早期的远处播散。本研究发现在卵巢上皮性癌组织中p130Cas的蛋白表达明显高于正常卵巢组织。在临床期别晚、有淋巴结转移的卵巢癌患者中，p130Cas表达显著增高(P＜0.05)。提示p130Cas在卵巢上皮性癌组织中的高表达可能与卵巢癌的浸润转移和病程进展有关。

3.4 DLC-1和FAK及p130Cas在卵巢上皮性癌组织中表达的相关性 DLC-1定位于局部黏着斑，因此要发挥其肿瘤抑制活性，对局部黏着斑的定位是必需的［15］。Kim等［2］在肝细胞癌中研究发现:DLC-1可导致局部黏着斑蛋白如黏着斑激酶(FAK)、信号分子p130Crk相关底物(p130Cas)以及桩蛋白(paxillin)的去磷酸化，从而抑制癌细胞的迁移。p130Cas是局部黏着斑形成和细胞迁徙所必要的局部黏着斑复合体相关蛋白。DLC-1使p130Cas酪氨酸去磷酸化，导致肝癌细胞迁徙能力下降。同时，DLC-1表达引起FAK的去磷酸化失活，抑制了粘着斑的形成，使肿瘤细胞粘附性降低，从而诱导凋亡。以上均说明DLC-1抑制肿瘤细胞侵袭的作用可能是通过对FAK和p130Cas去磷酸化实现的。

本研究发现在卵巢上皮性癌中，DLC-1和FAK及p130Cas中的蛋白表达呈负相关。初步说明3者在卵巢癌发生发展中的重要作用。推测低表达的DLC-1通过使FAK及p130Cas去磷酸化，从而在卵巢上皮性癌的发生尤其是浸润转移中发挥作用。3者在卵巢癌中的表达均与淋巴结转移有关，提示在卵巢上皮性癌细胞的浸润和转移中，3者可能发挥某种重要的协同作用，尚有待于进一步的研究。本研究初步确定了DLC-1和FAK及p130Cas在卵巢上皮性癌中的表达以及与各临床病理特征之间的关系，在一定程度上揭示卵巢上皮性癌发生发展中可能存在的分子生物学机制，3者蛋白表达之间负调控的关系为抑制卵巢恶性肿瘤发展提供一个很好的理论基础，为更好的寻求新的治疗靶点提供广阔的思路，在卵巢上皮性癌的临床治疗尤其是对肿瘤浸润转移的干预方面可能有潜在的临床价值。

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