针药结合对慢性应激抑郁模型大鼠海马脑区NGF的影响*

张 瑜，王亚军，田永萍，侯春英，赵 学

(1.甘肃中医学院附属医院，甘肃兰州730020;2.甘肃中医学院，甘肃兰州730000)

抑郁症是一种常见的情感性精神障碍，以情绪低落、思维迟缓、意志活动减退的“三低”症状为主症，可伴有许多躯体症状，重时伴有自杀倾向，严重影响到患者的生活、工作能力。随着社会竞争压力日趋增大，抑郁症的患病率逐年增高，该病在世界致残病因中排名第4位，且有反复发作的特点，已成为严重危害人类健康的最常见的心理疾病。抑郁症的病因与多种因素相关，目前只针对某一发病环节的抗抑郁西药有效率也只有67%，且需长期服药，加之毒副作用多，价格昂贵，患者服药依从性差，反复停药又致使病情缠绵难愈。中医药治疗着眼于多靶点、多环节，对人体机能有着整体调节的作用，对抑郁症的治疗显示出极大的潜力。笔者在临床应用针药结合方法(针灸结合西药、针灸结合中药)治疗抑郁症取得了较好的疗效，显示针药结合治疗具有减毒增效、患者依从性较好的优点。目前揭示其机制的相关研究报道不多。本实验旨在揭示针与药的抗抑郁机理，阐明二者治疗作用的互补性，以期为临床治疗抑郁症提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级 SD大鼠 70只，雄性，体质量 160～190 g，由甘肃中医学院科研实验中心提供。质量合格证号:SCXK(甘)2004－0006－C000182

1.2 药品、试剂与仪器

复方逍遥散加减，方药组成:当归10 g、白芍10 g、柴胡12 g、茯苓10g、白术10 g、甘草3 g、生姜6 g、薄荷3 g。按照质量︰体积=1∶1进行浓缩。氯丙咪嗪，25 mg/支，湖南洞庭制药厂产品，批号20050221。NGF免疫组化试剂盒、DAB试剂盒，由武汉博士德公司提供。G6805型电针仪;BH2型光学显微镜，日本奥林巴斯公司产品;BL2000图像分析系统，成都泰盟科技有限公司产品。

1.3 动物分组与模型的建立

按数字随机表法将动物随机分为正常组、模型组、西药组、中药组、电针组、电针加中药组、电针加西药组，每组10只。

慢性应激抑郁模型制作参阅文献方法［1］改进。除正常组大鼠进行正常饲养，不予任何刺激外，其余各组给予多种不可预知的长期应激刺激制作抑郁症模型。采用慢性应激结合孤养的方式进行造模，刺激包括冷水游泳(5℃，3 min)、夹尾(1.5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、电击足底(电压为45 V，电击5 s，间歇5 s，共进行2 min)、昼夜颠倒(24 h)、温箱(45℃，5 min)，每天随机安排1种刺激方式，共进行28 d各种不同的刺激。

1.4 治疗方法

给予大鼠多种不可预知的应激刺激，从8 d后开始，各治疗组在给予应激刺激的同时开始治疗。西药组每天给予氯丙咪嗪2.5 ng/g，腹腔注射给药。中药组以复方逍遥散加减方灌胃，参照《实验针灸学》［2］，每只动物按照动物体表剂量进行换算，给药剂量5.76 mg/g。1 d 1次，共计21 d。实验期间，每7 d称量体质量1次，以便调整给药剂量。电针组:参照《实验针灸学》，取穴的解剖位置相当于人体的百会、印堂、三阴交(双)，平刺进针，接G6805型电针仪，疏密波，频率100 Hz，电压6V，强度以引起大鼠肢体轻微抖动为宜，于每日应激刺激前进行电针，持续15 min。1 d 1次，共计21 d。电针加中药组:先电针刺激，再进行中药治疗，方法同上。电针加西药组:先电针刺激，再进行西药治疗，方法同上。模型组给以与针刺组同样的抓取，但不予任何治疗。

1.5 检测指标

光镜下观察大鼠海马脑区病理组织学变化，并用免疫组化法测定组织中神经生长因子(nerve growth factor，NGF)表达。于治疗完成后第2天，将大鼠乙醚麻醉后开胸，升主动脉插管，剪开右心房，先灌注生理盐水200 mL，再灌注40 g/L多聚甲醛150 mL，持续30 min;取出脑组织海马区，以40 g/L多聚甲醛固定，于4℃冰箱保存。常规包埋组织，脱蜡，行HE染色，镜下观察海马局部病理变化，然后按照试剂盒说明进行NGF免疫组化染色，并测量。每只动物取相同部位的5张切片，每张在大脑海马的CA1、CA3、DG区分别取10个视野，在10×40倍光镜下进行图像分析，计算NGF平均灰度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数(x－)±标准差(s)表示，进行单因素方差分析，组间比较采用q检验。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠海马脑区病理组织学对比

正常组:海马CA1、CA3区排列规则，细胞层次丰富，海马结构清楚，神经细胞膜清晰完整，尼氏体丰富，胞核形态正常，核仁清楚，胞体伸出多个突起，血管及间质如常。模型组:海马CA1、CA3区神经细胞排列欠规则，细胞层次减少，海马结构尚清，神经细胞膜完整，尼氏体减少，部分胞核体积减少，染色加深，核仁不清，小胶质细胞及间质未见明显异常。经过治疗后，电针组可见CA3区神经细胞稀疏欠规则;中药组细胞数目有所减少;电针加中药组、电针加西药组见海马CA1、CA3区神经细胞无明显改变，神经细胞排列较整齐和紧密，细胞数目有所减少，但较模型组轻。

2.2 各组大鼠海马脑区NGF免疫组化染色对比

正常组:海马结构及齿状回神经细胞胞浆内有大量棕色细颗粒，细胞排列密集，着色深，有的有较长的突起。模型组:阳性细胞数量明显减少，且多数细胞呈空泡状，胞浆着色很浅，海马区及齿状回神经细胞胞浆内有极少量的棕色颗粒。中药组、电针组:细胞着色深，海马区及齿状回神经细胞胞浆内有较多棕色颗粒。电针加中药组、电针加西药组:细胞排列密集，层次较多，海马区及齿状回神经细胞胞浆内有多量棕色细颗粒。

2.3 治疗第21 d时各组大鼠海马脑区免疫组化灰度值对比

治疗第21 d时，与正常组对比，模型组海马CA1、CA3及DG的NGF阳性神经元的免疫组化平均灰度值明显升高，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型组对比，各治疗组海马各区CA1、CA3、DG的NGF阳性神经元的免疫组化平均灰度值均明显降低，差别有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);中药组和电针组CA1区的NGF阳性神经元的免疫组化平均灰度值较正常组高，差别有统计学意义(P＜0.05)，西药组、电针+中药组、电针+西药组与正常组对比，差别无统计学意义(P＞0.05);各治疗组组间对比，差别亦无统计学意义。见表1。

表1 各组海马神经元NGF免疫组化灰度值对比 ±s

表1 各组海马神经元NGF免疫组化灰度值对比 ±s

注:与正常组对比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组对比，#P＜0.05，##P＜0.01。

?

3 讨论

大量研究表明，慢性应激时，机体神经—内分泌—免疫网络失衡，由于一系列的神经生化改变可导致大脑器质性损害，而与情绪密切相关的边缘系统尤其是脑海马结构最易受到损害。海马是学习、记忆、认知的重要脑区，也是调节应激反应并受应激影响的最重要的脑部结构之一。所以，海马损伤可能与抑郁情绪的发生有关［3］。

本实验观察到:抑郁模型大鼠的海马CA1、CA3区，神经细胞排列欠规则，细胞层次减少，海马结构尚清，神经细胞膜完整，尼氏体减少，部分胞核体积减少，提示海马区正常的神经结构受损;抑郁组大鼠海马神经元NGF免疫反应阳性颗粒数目减少，着色浅淡，同正常组对比，差别有统计学意义(P＜0.01)，提示抑郁症大鼠海马神经元NGF含量降低，这与以往的研究结果类似［4－5］。提示抑郁症的发生与海马的神经元损伤和海马区的NGF功能密切相关。

中医典籍中没有抑郁症的明确记载，但历代文献中有“郁症”、“百合病”、“癫证”等的描述与本病临床表现相似，现抑郁症已明确归属于“郁证”范畴。中医学认为:肝主疏泄，肝的疏泄功能具有调畅情志的作用。情志不畅，肝失疏泄，气机郁滞，犯脾克胃，必致脾胃升降失常，气血乏源，营血渐耗，则心失所养，神失所藏，五脏失和，终致精神情志活动的异常。可见“肝郁”是本病的病机核心;五脏皆藏神，而心主神明，为五脏六腑之大主，神之根在阳气，脑又为“元神”之府，诸阳之会，故脑神失调是抑郁症的主要病理;本病的病位主要在心和脑，但脑的功能隶属于五脏，而心神受损，必然与脾、肾等多个脏腑相关。故治疗上以疏肝解郁为重，但调神健脾、宁心安神亦是不可或缺的重要环节。

针刺治疗情志病由来已久。心主神明，“脑为元神之府”，为精神、意识所出之所，为诸阳之会;心主血，上供于脑，血足则脑髓充盈，故心与脑息息相通。针灸治疗抑郁症就是以此为中心环节，以宁心调神理气为治疗原则，畅达气机，心脑同治。本实验采用的百会、印堂、三阴交，是目前临床针灸治疗抑郁症频率处于高位的腧穴［6］。百会位居巅顶，为督脉经穴，督脉总督一身之阳气，上至风府，入属于脑，络肾，肾生髓，脑为髓海;且督脉与肝、心、脾、肾等脏腑也均有联系，这些脏腑经络同人体情志活动密切相关。故针百会可健脑益智、疏通经络、调畅情志、调整脏腑功能，从而恢复心脑的正常功能;印堂居额部，为经外奇穴，具有调神醒脑之功;三阴交为足厥阴肝经、足太阴脾经、足少阴肾经的交会穴，可调整肝、脾、肾功能，起到疏肝理气、健脾调心、健脑宁神的作用。诸穴相配，气血和顺，阴阳调和，脑健神清，脑髓生化有源，以调整情志异常。

逍遥散是中医调治情志活动异常的经典名方，功在疏肝解郁健脾和营。本实验结果显示，无论是中药逍遥散还是电针组治疗后，均可见海马区及齿状回神经细胞着色深，胞浆内有较多棕色颗粒，海马各区CA1、CA3、DG的NGF阳性神经元的免疫组化平均灰度值均明显升高，同模型组对比，差别有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。此提示逍遥散和本针灸处方均可有效改善大鼠的抑郁状态，均有升高抑郁症大鼠海马脑区神经元NGF阳性表达的作用，这可能是它们治疗抑郁症的共同机制之一。

本实验结果提示中药、针灸治疗抑郁症与抗抑郁西药氯丙咪嗪的疗效相当，但西药毒副作用多，病人依从性较差。针灸和中药是简验效廉的方法，对于抑郁症的治疗有着积极的临床应用价值，也将给抑郁症患者提供更多的医疗选择。

本实验中，针药结合治疗两组(电针加中药组、电针加西药组)均可以使大鼠海马各区NGF的阳性表达增加，虽然与西药、中药组相比，海马各区NGF的阳性表达差别没有统计学意义，但电针组、中药组治疗后，CA1区NGF免疫组化染色平均灰度值尚未完全恢复到正常水平，与正常组对比差别有统计学意义(P＜0.05)，而针药结合组则完全恢复到正常水平。由此看出，针药结合治疗对改善海马NGF的表达有较好的作用，可能对海马脑区神经元的功能具有较好的保护作用，提示针药结合方面具有一定的治疗优势。

有研究显示，对实验性抑郁症大鼠海马区神经生长因子(NGF)含量减少，可通过提高脑内神经生长因子水平抵抗应激引起的脑组织损伤。侧脑室给予神经营养因子，可改善因慢性应激所引起的海马神经元组织学变化以及抑郁样行为［7］。本实验各组治疗方法均能提高NGF的在海马脑区的表达，这可能是其发挥治疗作用的机制之一。本实验由于条件所限，未能观察针刺、中药、电针加中药、电针加西药是否对NGF基因转录具有干预作用，此有待进一步研究。

［1］Willner P.The validity of animalmodels of depression［J］.Psychopharmacology，1984，83(1):1.

［2］李忠仁.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:1.

［3］Sapolsky RM.Glucocorticoids and hippocampal atrophy in neuropsychiatric disorders［J］.Arch Gen Psychiatry，2000，57(10):925－935.

［4］严进，路长林，何成，等.神经营养因子在应激反应中的作用［J］.中华精神科学杂志，1998，31(3):20－23.

［5］王雪琦，由振东，赵小林，等.抑郁症大鼠海马和顶叶皮质神经元NGF含量及其mRNA的表达［J］.第二军医大学学报，2002，23(6):590－592.

［6］吕梅，王玲玲.针灸治疗抑郁症穴位频次的分析［J］.针灸临床杂志，2003，19(8):6.

［7］王雪琦，路长林，孙学军，等.侧脑室微量注射神经生长因子对实验性抑郁症大鼠抑郁行为和海马神经元损伤的影响［J］.中国行为医学科学，2002，11(5):481－484.