靶向ORFV-DNA p loymerase基因shRNA表达载体的构建

于永忠，郭雯，吴欣媛，王金珍，崔玉东

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

羊口疮（Orf）又称羊传染性脓疱（Contagious Ecthyma）是由羊口疮病毒（ORFV）引起的一种急性的、接触性的、高度嗜上皮性传染病，该病以在绵羊、山羊等动物的口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征，主要引起皮肤和黏膜的增生性病变[1-2]。目前，该病几乎分布于世界所有养羊的国家和地区，同时也有人员感染的报道[3-4]。由于Orf在防治上缺乏有效的疫苗，而RNA干扰技术可能成为的抑制目的基因表达，控制病毒复制的有效手段。1998年，Fire等人发现dsRNA（Double strand RNA）能够比反义RNA或顺义RNA更有效地关闭基因的表达，称这种现象为RNA干涉（RNA interference，RNAi）[5]，并推测RNAi可能广泛存在于各种生物体中，是生物进化过程中一种重要防御机制。RNAi作为一种新的基因阻断技术，具有特异、有效的基因沉默效应，能够简单、高效地阻抑特定基因表达，现已广泛用于抗肿瘤，抗病毒的基因治疗，RNAi及其相关的RNA基因沉默机制被认为在抵御病毒入侵和转座子表达中起到关键性的作用[6]。由于在病毒中利用RNAi技术仍需要通过转化载体导入能产生发夹结构RNA（Short-hairpin RNA，shRNA）或dsRNA的表达单位，方便有效的RNAi表达载体的构建成为高效利用RNAi技术的关键。DNA ploymerase基因是ORFV复制的关键性基因，如果对于该基因能够运用RNAi技术加以体内沉默，无疑会为Orf的防控开辟新的思路，由此，研究目的是利用慢病毒载体（Lentiviru vector）pLL3.7包装质粒构建pLL3.7-hsRNA系统，从而为体外获得靶向DNA ploymerase基因的 siRNA（Small interfering RNA）片段重组载体提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与载体 羊口疮病毒ORFV（OV/HLJ/04）株由黑龙江八一农垦大学生命科技学院细胞生物学实验室保存；表达载体pLL3.7由中国农业大学动物科学技术学院连正兴教授惠赠。

1.1.2 试剂 胎牛血清FBS、改良型RPMI-1640培养液购自于Soarbio公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶XhoⅠ、HpaⅠ购自Promega公司；LA-TaqDNA聚合酶、氨苄青霉素为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司的产品；其他化学试剂为国产分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 shRNA设计与制备

根据GenBank公布的DNA聚合酶序列利用在线软件 （https：//rnaidesigner.invitrogen.com） 设计shRNA，并将靶序列通过基因BLAST分析以排除siRNA非特异性抑制其他基因的可能并选出分值较高的3个候选片段，起始点分别为596、875和947，分别命名为D-875、D-947和D-596，如表1所示。一般构成模式为：正义 TG sen TTCAAGAGA anti CTTTTTTC（HpaⅠ）；反义TCGAG AAAAAAG sen TCTCTTGAA anti CA（XhoⅠ）。TTCAAGAGA能够形成发夹结构；每个片段设置XhoⅠ和Hp aⅠ位点。各互补单链由上海生工公司合成。将合成好的单链用ddH2O溶解，终浓度为10 nmol·Μl-1。正义、反义链各取10μl或20μl等量混合后，煮沸2～3min，使其自然冷却至室温，4℃保存。

1.2.2 pLL3.7-shRNA质粒构建

pLL3.7质粒经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用XhoⅠ和HpaⅠ37℃双酶切3～4 h，80℃灭活20min。取少量电泳鉴定。将制备好的shRNA片段与酶切后的pLL3.7质粒，以T4连接酶22℃连接1 h。取少量电泳鉴定。然后将构建完的pLL3.7-shRNA转化感受态细胞BL21。挑菌落摇培后采用菌液PCR鉴定，两条引物分别为F：GGAAACTCACCCTAACTGTAAAG；R：GACCTGCTGCTGGAATCTCGT。鉴定正确后，用质粒提取试剂盒小提质粒，酶切鉴定。鉴定正确后送上海生物工程公司测序。

表1 OFRV的DNA聚合酶基因RNAi的shRNA片段设计Table 1 shRNA fragment de sign of DNA Polymerase ge ne RNAiof OFRV

图1 pLL3.7-shRNA重组质粒模式图Fig.1 Pattern of recombinant plasmids

2 结果

2.1 pLL3.7质粒的鉴定结果

将慢病毒质粒pLL3.7进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在对照存在的情况下，pLL3.7的大小为7 650 bp，与对照质粒大小一致。如图2所示。

图2 pLL3.7琼脂糖凝胶电泳鉴定结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of pLL3.7 vector

2.2 pLL3.7质粒载体的酶切及DNA连接鉴定结果

将质粒热转化至x-LIBlue大肠杆菌感受态细胞中，37℃摇床中振荡培养过夜后，提取质粒，用XhoⅠ和HpaⅠ进行双酶切，使用DNA纯化/回收试剂盒回收质粒。双酶切后的pLL3.7载体大小为7 650 bp，酶切鉴定结果如图3所示。将pLL3.7载体分别与D-875、D-947和D-596连接，然后取少量进行电泳鉴定，结果如图4所示。

图3 质粒pLL3.7双酶切鉴定结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of pLL3.7 vector digested by XhoⅠand HpaⅠ

图4 重组质粒pLL3.7鉴定结果Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of recombinant plasmid pLL3.7

2.3 重组菌抗性筛选结果

将构建完的pLL3.7-shRNA分别转化感受态细胞DH5α，次日观察转化结果。挑菌落37℃摇培4～5 h后采用菌液PCR鉴定插入片段，两条引物分别为F：GGAAACTCACCCTAACTGTAAAG；R：GACCTGCT GCTGGAATCTCGT。PCR产物电泳鉴定结果如图5所示，提示重组表达载体Sh-pLL3.7-D596符合实验预期结果（比未插入者多出60 bp左右）。用质粒提取试剂盒小提质粒，送测序。如果序列准确可以用于转染293T细胞。

图5 插入片段的PCR鉴定结果Fig.5 PCR result of the inserted fragments

3 讨论

目前，慢病毒载体已被广泛地应用于表达RNAi的研究中[7-9]。采用这种事先在体外构建能够表达shRNA的载体，然后转移到细胞内转录shRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成shRNA试验效果，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。然而，作为一个新兴的、机制尚未完全清楚的新技术，RNAi技术发展需要关注以下几点：（1）网上资源的差异性对于siRNA设计的优劣、病毒基因组数据库的可获得性及准确性的潜在影响。据Snover[11]的报道，发表过的359段siRNA序列中有75%存在诱发非特异性效应的风险。（2）客观存在的不确定因素造成的数据偏差，比如同一段靶mRNA不同位置的相应siRNA其基因沉默效率显著不同[10]。实际上，与商业的siRNA或通过独立的正义和反义RNA片断形成dsRNA或shRNAs转染细胞产生RNAi效应相比，细胞内产生siRNA诱导的RNAi有着更长效的基因沉默效应[11]。现在，为大幅提高PCR的特异性和效率，降落（touch down，TD）PCR技术已经大量地进入医疗临床应用。以高通量PCR为基础的检测方法、如人HLA分型大多采用这一技术。采用该技术，李玉恒等所建立的TD-PCR法，可检出极低浓度的核酸，如此高的灵敏性将会准确显示不同环境下不同组织中CIRP含量的微小变化[12]。研究通过Invitrogen网络自动设计平台筛选并合成了3个shRNA片段互补单链，将该靶序列Oligo DNA退火，并分别与含有U6启动子的pLL3.7慢病毒载体质粒构建重组载体，经过转化DH5α感受态细胞，最终获得一个阳性重组子pLL3.7-D596，进一步测序结果显示正确。pLL3.7慢病毒载体系统的U6启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达大约21 ntRNA和大约50 ntRNA茎环结构（Stem loop）。同时在包装成功后，感染细胞时病毒可表达EGFP，有利于测定其病毒滴度，并有利于检测其感染效率。研究从转化结果来看，转化效果并不理想，需要进一步优化实验方法和条件。此外，阳性重组子pLL3.7-D596比pLL3.7-D947和pLL3.7-D875明显增加几十个核苷酸，在结果判定时容易辨别。

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