桔梗不育特性及育性稳定性研究

刘自刚，呼天明，汪玉琳，王新军，杨亚丽，张 雁，何 军，雷燕妮

(1.商洛学院生物医药工程系，陕西 商洛 726000；2.西北农林科技大学动物科学学院，陕西 杨凌 712100)

桔梗(Platycodongrandiflorum)为桔梗科桔梗属，是一种药、食、赏兼用的多年生双子叶草本植物。丰富的种质资源是进行遗传研究和种质改良的物质基础，具有特异性状桔梗种质的鉴定及其遗传信息的占有是科学开展良种培育的前提，随着桔梗种质观察研究的不断深入，一些新的种质类型不断被发现[1]。

在高等植物中雄性不育是一种很普遍的遗传现象，到目前为止已在43科162属297种中发现了雄性不育的存在[2-6]。植物雄性不育性是特殊的育种目标性状，通过雄性不育系进行杂交制种利用杂种优势已成为许多异花乃至自花授粉植物的主要育种方向[7-8]。目前对桔梗雄性不育的相关报道较少，仅有魏建和[9]、吴日基等[10]、王志芬等[11]、刘自刚等[12]各自在不同群体中先后发现并鉴定了桔梗雄性不育突变体并对其进行了初步研究，魏建和[9]还对桔梗雄性不育发生的细胞学机理、遗传特性等进行了初步探讨，但尚未见桔梗雄性不育稳定性方面的相关报道。本研究对桔梗不育种质从生殖结实特性、育性稳定性等方面进行研究，以期为桔梗育性特异种质的进一步发掘和杂种优势利用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 2006年7月在进行桔梗去雄杂交、套袋自交的过程中，在当地生长2年的桔梗栽培群体中发现了1株雄性不育单株。随后在种质资源圃及大田中，对桔梗花器形态结构展开了大量的田间观察和花粉活力的鉴定，又相继发现了桔梗不育材料14株，并编号为PA1～PA14。PF、PCF、ZB分别为商洛、赤峰、淄博栽培种中筛选的可育单株。

1.2方法

1.2.1不育花形态结构及传粉生物学研究 对不育花花器结构、柱头运动、单花花粉量、胚珠数、不育花结实率，不育株系开花物候期，传粉昆虫的种类和行为进行统计观察；胚珠活性采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)测定，花粉活力采用I2-KI 染色法测定，不育花结实特性采用人工授粉法，授粉后套袋挂牌标记，成熟后统计结果率和结籽率，以衡量柱头寿命。

单花花粉量测定方法：分别随机选取即将开放的花蕾(花药未开裂)各10朵，每株采1朵，固定于FAA中，带回实验室备用。从花中取下花药，用1.0 mL·L-1HCl软化花粉壁。然后细心的解剖花药，将花粉全部移入1个有刻度的离心管，用蒸馏水定容至4 mL。在振荡器上震荡2 min后，用移液枪吸取1 μL的花粉液于载玻片上，在显微镜下观察并统计花粉数，每个花药重复5次；花粉/胚珠比率(P/O)用其花药中的花粉数除以其子房中的胚珠数得出。

1.2.2不育株结实率鉴定 于花期对筛选的12个不育单株材料，分别进行人工授粉、套袋自交和自然授粉3种处理，并挂牌标记，处理后10 d除去套袋；在研究中发现桔梗具有自交不亲性，且主要由雌雄蕊异熟和花后柱头绒毛隔离花粉造成的。因此，采用延迟授粉的方式进行人工授粉，即花前1 d套袋，套袋后3 d再人工授以新鲜花粉；种子成熟后统计结实率、结籽率。

1.2.3桔梗不育性对温度的反应 将同一不育株材料的无性繁殖后代单株，分别培养于相同规格的两个培养盆中，花芽分化期将一盆放置于人工气候箱内，设置箱内温度比同期室外温度低4～6 ℃；另一盆放置于室外自然环境，保持室内外温差在开花后进行育性鉴定。

1.2.4桔梗不育性对光照的反应 盆栽采用植盆规格为25 cm×20 cm、装土量及盆土养分一致。材料为败育彻底单株PA14的无性繁殖后代；光照长度控制采用遮光处理缩短光长、人工补光延长光长，中断暗期处理在人工气候箱中进行。于花芽分化期进行光照处理，暗棚遮光(双层黑布罩)处理设3个日长，分别为9、12和15 h·d-1；中断暗期处理为每天00：00人工光照1 h。开花后鉴定不育性变化情况。

1.2.5环境对桔梗不育性的影响 选用桔梗雄性不育株的无性繁殖后代分别在3个不同纬度的地区(云南昆明、陕西商洛、山西代县)定植，于花期观察育性表现，统计花粉量、花粉败育率。

1.2.6主要营养元素对桔梗育性的影响 将桔梗不育株系分别定植于红壤、沙质土、黄土3种不同质地土壤中，土壤肥力情况见表1。于花期观察育性表现，统计花粉量、花粉败育率。

表1 不同土壤类型的化学性状

1.2.7不育性遗传特性研究 用不育材料和来源不同的桔梗可育单株组配，于花期调查花期观察育性表现，并调查不育株数，计算不育株率，统计育性表现情况。

1.3数据分析 利用SPSS软件和Excel对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1桔梗不育花形态结构及生殖特性研究

2.1.1花形态特征 桔梗不育花花冠大小、花瓣颜色、子房大小与相同来源的可育花相比没有明显差异；但不育花柱头比可育花略大，色泽也较深为蓝色，柱头外被白色绒毛，无或少有花粉附着；花药干瘪萎缩为灰褐色，与柱头相离，宽仅为可育花花药的1/3，长为2/3左右(图1)。

图1 桔梗不育花、正常花、正常花粉及典败花粉形态

2.1.2花粉量、胚珠数和花粉胚珠活性 桔梗可育花单花花粉量为146 880，胚珠数197.6枚，P/O较高，为743.3(表2)；可育花粉经I2-KI 染色均匀且为褐色，花粉粒正五边形或正六边形；胚珠与TTC反应被染成深红色，具有较高活性。桔梗不育单株PA1、PA3、PA4、PA5、PA6、PA7、PA9 和PA11有微量花粉产生，染色镜检后发现花粉外形呈不规则状，不能被I2-KI 染色，为败育花粉，其余不育单株花药中无花粉产生；不育花单花平均有胚珠203.4枚，比可育花略多，发育正常，且活性与可育花胚珠相当。

表2 桔梗不育花和可育花单花花粉量、胚珠数比较

2.1.3不育花结实率 桔梗不育花与正常花异花授粉和自花授粉结果率、结籽率和亲和指数均较高，不育花与相同来源的可育花在结实性上无明显差异；不育花自交不能结籽，桔梗不育花花粉无授粉活力，表明不育花雌蕊正常可育而雄蕊不育，发现的桔梗不育单株确为雄性不育突变材料(表3)。

另外，自花授粉和异花授粉两种处理，均选用开花后3 d已开裂柱头授以自花花粉(同一植株花朵花粉)或异花花粉(不同植株花朵花粉)的方法，研究结果显示，桔梗自交和异交结籽率、亲和指数均较高，两种授粉方式在结实能力方面无明显差异(表3)，表明延迟3 d授粉是克服桔梗人工授粉结实率低的有效途径。

2.2桔梗雄性不育稳定性研究

2.2.1栽培地对不育性稳定性的影响 选用同一桔梗雄性不育株的无性繁殖后代、可育单株PCF1、PCF2分别在3个不同纬度的地区(云南昆明、陕西商洛、山西代县)定植，于花期统计育性表现(表4)。桔梗不育单株PA4败育彻底，在不同栽培地不育性表现稳定；不育株PA5在不同栽培地花粉量略有所变化，表明桔梗彻底败育单株不育性很少受环境影响，而微量花粉单株其花粉量在一定范围内受环境的修饰。

表3 桔梗不育花与可育花结实比较

表4 不同栽培地对不育性稳定性的影响

表5 不同土壤肥力对育性表现的影响

2.2.2土壤肥力对不育性稳定性的影响 不同类型的土壤肥力各指标均不相同，其中以红壤肥力较高，沙质土肥力中等，黄土肥力最低(表1)。将同一桔梗单株的无性繁殖后代栽培于化学性状不同的土壤中，在不同土壤肥力栽培条件下，桔梗不育株和可育株单花花粉量均无明显变化(表5)。表明土壤肥力对桔梗不育株花粉量的形成无明显影响，土壤肥力对桔梗不育稳定性无明显作用。

2.2.3不育性在年际间的表现 在商洛地区2006-2008年对桔梗彻底败育单株PA4和微量花粉单株PA5进行连续3年的育性调查统计结果表明，不育单株PA4在2006-2008年单花花粉量均为0，不育性年际间表现较为稳定；PA5在不同年份单花均产生微量花粉，单花花粉量在年际间略有变化(表6)。

2.2.4温度对桔梗不育稳定性的影响 在自然温度条件下，桔梗单株PA2花药干枯瘪小，花药中无花粉量产生，而在低温条件下，花药外形略有增大，产生少量败育花粉；微粉单株PA13在低温条件下花粉量有所增加，而且产生少量的可育花粉(表7)。表明在低温条件下桔梗微量花粉单株其花粉量有明显增加，而温度对桔梗彻底败育单株育性影响较小。

表6 桔梗育性年际间的表现

表7 温度对育性表现的影响

2.2.5光照对桔梗不育稳定性的影响 9、15 h光照处理下PA14产生极少败育花粉，12 h和中断暗期处理条件下PA14未见花粉形成(表8)，表明光照长度对桔梗不育性表现无明显影响。

表8 光照长度对育性表现的影响

2.3桔梗雄性不育性遗传特性研究 PA2、PA4为商洛栽培居群中筛选鉴定出的败育单株，FA1～16为商州栽培居群中筛选的可育单株，PF2、PF3、PF5分别为唐塬、丹凤、洛南栽培种筛选出的可育单株；ZB1和ZB2为淄博栽培种中筛选的可育单株，2007年以不育株为母本、可育株为父本配置组合。不育株PA2、PA4与来源相同的可育株之间的组合后代，除了PA2×PF3组合后代出现5%左右的可育株外，其余组合后代均不育；而PA4与源于淄博的两个可育单株的组配后代均表现可育(表9)。表明在商洛栽培种中存在不育材料PA2、PA4的保持基因，而在淄博栽培种中存在不育材料的恢复基因。

表9 不育性株后代的育性表现

3 讨论与结论

自然条件下，高等植物群体中出现雄性不育突变体是一种较为普遍的现象。桔梗不育种质在吉林[10]、山东[11]等地已有发现。本研究在2006年桔梗花期期间，在当地桔梗群体中发现桔梗雄性不育单株12个，并用22份来源不同的桔梗可育材料给其授粉，5个测交后代不育株率在95%以上，表明桔梗不育突变材料可以稳定保存。对不育突变单株花粉、柱头、胚珠活性以及结实特性进行了研究，结果显示不育花无花粉或有微量败育花粉，而柱头、胚珠发育正常，田间授粉结籽率与相同来源的正常花无明显差异，这与吴基日等[10]、王志芬等[11]的研究结果一致。新桔梗雄性不育突变体的发现拓宽了不育种质的遗传基础，并为桔梗杂种优势利用提供了物质材料。

植物性状表现受基因的控制，同时也或多或少地受到其生长环境的影响，性状表现是基因活动及其环境作用的总结果。魏建和[9]在不同桔梗种群中筛选出了雄性不育突变材料共15个单株，对其测交后代的遗传分析结果表明，这些不育材料分属两种不育类型，即核不育型和胞质不育型。这与本研究发现的桔梗不育材料的败育类型有所不同，对不育株组配的交配后代分析表明，雄性不育材料很可能为核质互作不育型，这为通过雄性不育性利用桔梗杂种优势提供了更为丰富的遗传材料。另外，对桔梗不育材料育性稳定性进行了研究，表明桔梗彻底败育单株在不同光照、不同温度、不同营养条件以及不同地域栽培等环境因子对其育性影响较小，而“微粉单株”花粉量变化在一定范围内受到环境的修饰。这一结果对新发现和鉴定的桔梗不育材料的评价提供依据，可为桔梗不育材料的利用途径及桔梗不育系选育策略的确定、亲本繁育及桔梗杂交种制种策略的制定、桔梗杂种优势利用潜在的经济风险评估提供理论依据。

植物杂种优势利用的途径主要是根据植物开花习性、花器特征、授粉繁殖方式以及特殊突变体材料特点等因素制定[13]。桔梗属常异花授粉植物，主要采用种子繁殖，但其药用部位为生长2年的根条，根据这一特点，通过质核互作不育性利用桔梗杂种优势的途径可设计为：不育系、保持系和强优系。通过不育系×强优系制备杂交种，这一模式和传统作物“三系”制种的不同在于传统作物获取种子为生产目的；通过不育系×恢复系生产的杂交种必须可育，而通过强优系制备的F1桔梗杂交种只要求根部产量，对于F1的育性没有要求。如果应用于生产的F1杂交种是不育的，那么制种父本则不适合再称为“恢复系”，同时为了与自交系相区别，将这种制种父本称为“强优系”。

[1]刘自刚,张雁,王新军,等.桔梗育种研究进展[J].中草药,2006,37(6):6-8.

[2]谢潮添,魏冬梅,田惠桥.高等植物雄性不育的细胞生物学研究进展[J].植物生理与分子生物学学报, 2006,32(1):17-23.

[3]陈海玲，石凤翎，徐军,等.苜蓿雄性不育系配合力和遗传力分析[J].草业科学,2010,27(10):64-68.

[4]王玖瑞,刘玲,刘孟军,等.枣树雄性不育新种质的获得[J].园艺学报,2006,33(2):374-377.

[5]赵团结,盖钧镒.大豆不育性自然变异的发现与鉴定[J].中国农业科学,2006,39(9):1756-1764.

[6]秦垦,田英,李云翔,等.宁夏枸杞雄性不育种质个体YX-1的发现与鉴定[J].西北植物学报,2006,26(9)：1838-1841.

[7]孟金陵.植物生殖遗传学[M].北京:科学出版社,1995:56-59.

[8]丁春邦，李强，李燕,等.重楼属9种5变种花粉活力与柱头可授性特性研究[J].草业学报，2009，18(4):61-66.

[9]魏建和.中药桔梗杂种优势利用基础研究[D].北京：中国中医研究院中药研究所，2006:96-98.

[10]吴基日,严一字,朴锦.桔梗雄性不育种质JXB-1的发现与鉴定[J].延边大学农学学报,2007,29(4):245-248.

[11]王志芬,苏学合,单成钢.桔梗雄性不育材料的发现与鉴定[J].现代中药研究与实践,2007,21(5):8-10.

[12]刘自刚,张雁,杨亚丽.桔梗雄性不育突变体的发现与鉴定[J].北方园艺,2009,27(1):40-43.

[13]辛金霞，戎郁萍.化学杂交剂在植物育种中的应用现状[J].草业科学,2010,27(3):124-131.