垂花百合花器官离体培养

刘 芳，王晓丽，张彦妮，杨青杰，周蕴薇

(1.东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆 163319；3.呼伦贝尔市蚕业科学研究所，内蒙古 呼伦贝尔 162650)

百合(Liliumspp.)是世界著名的球根花卉，观赏价值较高，培育高品质的新品种百合来满足日益增长的市场需求已迫在眉睫。而野生种百合则是品种选育的重要资源，野生种百合的微繁研究对于野生资源的驯化及新品种选育和遗传性状的改良等都极为重要[1-2]。垂花百合(L.cernum)在我国主要分布于吉林省长白山地区，在百合属植物中属珍稀耐寒野生种。利用组培再生的方法能够保证原种的优良特性和较高的繁殖系数[3]。目前，百合离体培养大部分以鳞片[4]作为外植体，也有以花丝[5]、花药[6]、子房[7]、叶片[8]、胚等作为外植体取得成功的报道。垂花百合具有良好的观赏性状，同时也是具较强抗性的野生种，是百合抗性育种的重要亲本。对垂花百合进行不定芽诱导及植株再生试验，发现中部或内部鳞片基部再生频率较高，再生植株叶片基部分化能力最强[9]；对其鳞茎进行诱导，发现鳞茎诱导最适宜的培养基为N6+0.05 mg·L-1IAA+0.50 mg·L-1KT，鳞茎萌发为完整植株的最佳培养基为N6+0.01 mg·L-1IAA+0.001 mg·L-1NAA[10]。但鳞茎作为地下贮藏器官，极易携带病菌，表面消毒后仍会不同程度地带菌，不利于种质长期保存和规模化生产；而花器官为幼嫩器官，污染小，同时研究花器官的离体培养也是对垂花百合生物学特性的有益补充。为此，本研究比较不同的激素配比条件下垂花百合花瓣、花托、子房愈伤组织的诱导和分化能力，筛选不同的愈伤组织诱导和分化效果最佳的培养基，以期为垂花百合的基因工程和细胞工程育种研究及百合产业发展提供有益参考。

1 材料与方法

1.1实验材料 选择来源于长白山地区生长健壮、无病虫害的垂花百合未开放的花作为外植体，进行花器官离体培养。

1.2实验方法 将垂花百合未开放的花蕾在洗衣粉水中漂洗10 min后，在流水下冲洗30 min，在超净工作台上用75%的无水乙醇消毒30 s，然后用2% NaClO消毒10 min，再用无菌水冲洗4～5次。用镊子和刀将花蕾分成花瓣、花托、子房3部分，接种于添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)MS培养基中。每处理30个外植体，重复3次。45 d时统计愈伤组织诱导率，65 d时统计愈伤组织分化率。

诱导率=(诱导愈伤组织外植体数/接种外植体数)×100%；

分化率=(分化成苗外植体数/诱导愈伤组织外植体数)×100%[11]。

将由花瓣诱导出的芽经增殖培养后，切成单株接入添加不同生长激素的生根培养基中，生根培养基成分为1/2 MS+AC 0.5 g·L-1附加不同浓度的吲哚丁酸(IBA)及NAA。每处理30个外植体，各处理3次重复。30 d后统计生根情况。培养条件为(25±2) ℃，光强为3 000 lx，光周期为光培养14 h，暗培养10 h。

2 结果与分析

2.1不同激素配比条件下花瓣愈伤组织诱导及分化情况 不同培养基对花瓣愈伤组织的诱导效果存在显著差异(表1)。在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1激素组合的培养基上，愈伤组织诱导及分化效果最好，诱导率可达57.65%，分化率可达81.12%。当NAA浓度升高，愈伤组织的诱导率及分化率相应提高，在NAA 0.1 mg·L-1水平上，花瓣未见愈伤组织形成，说明低浓度NAA不利于诱导愈伤组织。随着6-BA浓度的升高，愈伤组织分化成苗的分化率相应升高，说明较高浓度的6-BA有利于愈伤组织进行分化。

表1 不同激素配比条件下花瓣愈伤组织诱导及分化情况Table 1 Petals,ovary,and receptacle explants callus induction and differentiation of Lilium cernum under different hormone combinations

2.2不同激素配比条件下子房愈伤组织诱导及分化情况 在MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1激素组合的培养基上，子房愈伤组织诱导及分化效果最好，诱导率可达35.22%，分化率可达61.11%(表1)。并且随NAA浓度的升高，愈伤组织的诱导率及分化率也相应提高，高浓度NAA与低浓度NAA的培养基对子房诱导愈伤组织的效果存在显著差异；随着6-BA浓度升高，愈伤组织的诱导率先上升后下降。

2.3不同激素配比条件下花托愈伤组织诱导及分化情况 在MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的激素组合的培养基上花托愈伤组织诱导及分化情况最好，诱导率可达36.67%，分化率可达44.34%。在NAA 0.2 mg·L-1与不同浓度的6-BA的培养基中，花托愈伤组织诱导效果差异明显(表1)。当NAA浓度增加时，愈伤组织诱导率及分化率先增加后减少；随着6-BA浓度的升高，愈伤组织的诱导率先上升后下降。由此可知，花托诱导愈伤组织时，6-BA和NAA的浓度均不宜过高也不宜过低。

2.4百合花器官愈伤组织诱导及分化的比较

2.4.1不同花器官外植体愈伤组织诱导及分化的比较 垂花百合的花器官在离体培养过程中愈伤组织的诱导及分化的时间较长，外植体诱导愈伤组织由易到难依次为花瓣>花托>子房(图1)。

花瓣的分化率明显高于其他部位，且分化所需时间最短。接种3 d后花瓣颜色明显变深呈粉色(图1A)；20 d后部分花瓣切口处开始膨大，沟壑变明显，花瓣颜色变浅，35 d后开始形成绿色愈伤组织，40 d开始形成不定芽(图2B)；55 d后每个外植体上平均分化出芽4.8个，最多达14个(图1C)。

子房的诱导率和分化率次之，且时间较花瓣长。接种2 d后子房明显膨大，颜色变成黄绿色(图1D)；40 d时继续膨大，颜色变为绿色，部分子房切口处产生带有绒毛的白色根状物(图1E)；60 d后开始形成愈伤组织，65 d后开始形成不定芽(图1F)。

花托的愈伤组织诱导和分化的能力介于花瓣和子房之间，所需时间较花瓣长，较子房短。接种3 d后，花托明显膨大，表面变粗糙，颜色变为淡黄绿色(图1G)；45 d后开始形成愈伤组织，并且产生带有绒毛的白色根状物(图1H)；60 d后白色根状物也形成愈伤组织并产生不定芽(图1I)。

2.4.2不同激素组合对花器官愈伤组织诱导及分化的比较 在百合组培苗诱导过程中，适量添加NAA对愈伤组织诱导及分化有明显的促进作用。6-BA能诱导不定芽的产生，使其大量增殖，如果6-BA浓度过高，同样也会诱导部分外植体产生大量的不定根，从而抑制不定芽的形成，抽叶多，植株不能健壮生长和发育[12]。本研究中，花瓣、子房、花托3种外植体对低浓度的6-BA、NAA都不敏感，诱导花瓣愈伤组织及分化的培养基中6-BA、NAA浓度都很高，不同外植体诱导愈伤组织对激素配比浓度需求不同，诱导愈伤组织及分化效果也有差异。这种差异可能是由于百合品种及外植体的不同导致的。

2.5生根与移栽 将分成单株的小苗接于含有0.5 g·L-1活性炭，附加不同生长激素浓度的1/2 MS生根培养基中。结果表明，由花瓣诱导的小苗在1/2 MS+IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1的生根培养基中生根率最高达71.11%，平均根长达2.03 cm(表2)。随着IBA浓度的增加，垂花百合的生根率也升高。在本研究中，活性炭的加入有利于垂花百合的生根，使根的长度增加，长势变壮(图1J)。将根长2～4 cm的小苗炼苗3 d，然后移栽至已灭菌的蛭石中，浸透水后放入人工气候箱内缓苗，15 d后移到温室。移栽后的小苗生长良好，成活率可达80%(图1K)。方差分析表明，不同浓度激素组合的培养基对百合生根率及根长的影响均有不同程度的差异。

3 讨论

在百合的组织培养研究中，许多器官、组织都可以用作外植体，其中以鳞片作外植体的频率最高，但鳞片取材对母本伤害大，且消毒处理难度大、易污染[4，10]，未授粉的花器官培养和人工授粉后的花器官培养对培育百合新品种和保持母本优良特性有重大研究意义。

本研究对垂花百合花器官(花瓣、花丝、花药、花柱、子房、花托、花梗)进行了离体培养，其中花丝、花柱、花梗开始时膨大，形成愈伤组织，但后期大量褐化死亡，只有花丝在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1培养基上有两个分化不定芽，花药在培养期间未能形成愈伤组织及分化，表明垂花百合诱导愈伤组织由易到难依次为花瓣>花托>子房，但亚洲百合‘米丽拉’花器官组织培养再生植株不同部位的分化率从高到低依次为花丝、花柱、子房、花托、花瓣、花药[13]，这可能是由供试品种的差异性导致的。

图1 垂花百合花器官外植体愈伤组织诱导及分化Fig.1 Floral organ explant callus induction and differentiation of Lilium cernum

表2 不同激素组合对垂花百合生根的影响Table 2 Effects of different hormone combinations on rooting of Lilium cernum

植物生长调节剂在组织培养中发挥着重要的作用，在含量极低时就可以影响植物细胞的分裂、分化，以及植物体的生长、发育、形态建成等许多生理生化过程。研究表明，NAA对外植体愈伤组织诱导与分化起到一定的作用，较低浓度的NAA不利于诱导愈伤组织。这一结果与刘丽敏等[14]在百合花器官的组织培养中的结果一致，适宜浓度的NAA有利于百合花器官的初代诱导。

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