专性厌氧菌发酵罐制氢工艺

陈璐圆 钱春香

(东南大学材料科学与工程学院，南京211189)

氢气作为新一代绿色能源，具有清洁、高效、可再生等特点，若能够产业化生产，未来有望代替石油、天然气等化石能源，从而减轻对环境的压力［1］.氢能不是一次能源，需要从含氢的化合物中制取.目前全世界90%以上的氢来自化石燃烧，其余为水电解制氢，不论是哪种制氢方法都要直接或间接消耗大量的化石能源.生物制氢以其原料来源丰富、价格低廉等特点越来越受到人们的关注，是很有潜力的制氢方法之一［2］.

生物制氢包括光合生物制氢和厌氧发酵制氢2 种途径.后者具有产率高、速率快且持续稳定、反应装置的设计操作简单、原料来源广泛且成本低等特点，更易于实现规模化生产，因而成为生物制氢研究的主要方向［3］.厌氧发酵制氢菌种包括专性厌氧菌和兼性厌氧菌.其中，专性厌氧菌的培养、运输及工业化条件苛刻，比兼性厌氧菌具有更广泛的适应性和更高的产氢率［4］.然而，目前高效专性厌氧产氢菌种类较少，缺乏新型菌种，产氢效率偏低，并且制氢条件需进一步优化.

本文以筛选得到的一种可用于发酵制氢的新型专性厌氧菌P 为研究对象，在批式发酵试验的基础上，以葡萄糖和糖蜜为碳源，分析了利用该种专性厌氧菌发酵罐制氢的方法，以期为生物制氢工业化应用提供一定的技术方法.

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用由本实验室选育出来的专性厌氧菌P，用液体培养基进行稀释，培养时间为24 h.

液体培养基［5］组分包括:葡萄糖5.0～20.0 g，蛋白胨10.0～15.0 g，牛肉膏2.0～3.0 g，酵母提取物5.0～10.0 g，Na2HPO43.0～4.0 g，L-半胱氨酸0.2～0.5 g，L-半胱氨酸盐0.2～0.5 g，质量分数为0.2%的刃天青指示剂1 mL，马血清40～60 mL，蒸馏水1 L.

1.2 仪器及分析方法

生物发酵气体产物中的氢气和二氧化碳浓度使用GC9790A 型气相色谱仪TCD 检测器测定.相关仪器参数有:柱长2 m，柱箱温度120 ℃，进样温度100 ℃，氩气作载气，流速为30 mL/min，进样量为1 mL.使用标准气体成分得到相应气体的保留时间和峰面积，由此可计算得到待测的发酵气体成分［6］.

根据3，5-二硝基水杨酸比色法，使用752 紫外分光光度计测定还原糖浓度，然后通过葡萄糖浓度标准曲线计算得到底物中未反应还原糖的含量［7-8］.

采用光密度法测量菌悬液浓度，即利用752 紫外分光光度计在波长为600 nm 时，以蒸馏水为空白对照管，测定细菌的菌浊度即OD600［9］.

发酵液相pH 值使用精密酸度仪来测定.

1.3 实验方案

1.3.1 专性厌氧菌P 的生长倍增周期测定

首先以10%的接种量将菌液接种至200 mL培养基，然后调整培养基初始pH 值为7.0 后装入250 mL 无色锥形瓶中密封，放入(37 ±1)℃培养箱内静置培养，定时测定培养基OD600值.

1.3.2 以葡萄糖为底物的小样试验产氢能力测定

小样实验的产氢能力采用批式发酵工艺，试验装置如图1所示.采用的碳源为葡萄糖［10］，培养基为200 mL，设置4 组试验的葡萄糖浓度分别为5，10，15，20 g/L.纯菌种接种量均为10%;将发酵液初始pH 值调至7.0，此后不再调控;整个吹扫、接种过程均需在高纯氮气存在的厌氧箱中进行，保证厌氧条件.将反应瓶放入恒温汽浴振荡培养箱中，转速170 r/min，在(37 ±1)℃下培养24 h.

图1 制氢装置示意图

1.3.3 发酵罐扩大试验产氢能力测定

图2 发酵罐实体图

发酵罐产氢能力试验同样采用批式发酵工艺，发酵罐如图2所示，发酵罐工艺流程图如图3所示.首先在小样试验基础上，以所得最佳葡萄糖浓度及环境因子在发酵罐中扩大化产氢.然后研究糖蜜作为底物的产氢能力，糖蜜密度为1.34 g/mL，蔗糖质量分数为50%.设置5 组不同浓度下的产氢试验，分别是20，30，35，40，50 g/L.纯菌种接种量均为10%;将发酵液初始pH 值调至7.0，此后不再调控;其余操作同上.

图3 发酵罐工艺流程图

2 结果与讨论

2.1 专性厌氧菌P 的生长规律

将菌浊度OD600=0.291 的菌液按照10%的比例接种至200 mL 培养基，静置培养60 h，生长情况见图4，其累积产气曲线如图5所示.

图4 专性厌氧菌生长曲线

图5 专性厌氧菌P 的累积产气曲线

从图4可看出，专性厌氧菌P 的生长周期可分为4 个时期:适应(停滞)期、对数期、生长稳定期和死亡期.P 菌的停滞期较长，在静置10 h 之后OD600值才逐渐靠近0.2，此时微生物才能发酵产氢，由图5可看出，该阶段产气量几乎为零;在10～20 h 阶段，P 菌处于对数生长期，不仅细菌数量大量扩增，产氢能力也逐渐加强;20 h 后产气量达到最大值.可以判定，专性厌氧菌P 在10 h 后加速生长，细菌数量迅速增多.

2.2 葡萄糖浓度对发酵气体总产量的影响

无菌厌氧操作下，将培养的P 菌高浓度菌液与培养基按10%的比例接种于200 mL 的培养基中，底物浓度分别是5，10，15，20 g/L.然后将接种好的发酵液封闭并从厌氧箱中取出，于温度为(37±1)℃、转速为170 r/min 的摇床振荡培养并连接氢气收集装置.在培养过程中，收集气体并实时记录气体产量.

实验结果表明P 菌产气总持续时间约24 h.底物浓度对P 菌气体总产量的影响见图6.最大产气量为480 mL，氢气量为302 mL，氢气体积分数为63%，适合于在发酵过程中应用.葡萄糖浓度高低对P 菌气体总产量和细胞生长的影响非常显著，当葡萄糖浓度为20 g/L 时，气体总产量最少，仅为255 mL/L，此时P 菌的细胞干重也只有0.38 g.在葡萄糖浓度为10 g/L 时，气体总产量达到最大值480 mL/L，细胞干重达到最大值0.73 g/L，但在低于或高于该浓度时，气体总产量和细胞干重都呈现下降趋势.

图6 底物浓度对气体总产量的影响

当葡萄糖底物浓度较低时，不能向P 菌提供充足的营养物质，从而使P 菌生长受到限制;而葡萄糖浓度较高时，P 菌对其不能完全充分地利用，残留的葡萄糖在反应瓶里堆积，使发酵液的pH 值降低，从而抑制P 菌生长，使其产氢受到影响.

2.3 以葡萄糖为底物的发酵罐扩大化试验对发酵气体总产量的影响

准备灭菌后的厌氧菌培养基6 L，将菌液以10%比例接种于6 L 液体培养基，于37 ℃发酵罐中培养，保持与发酵小样试验的所有环境因子相同，初始底物(葡萄糖)浓度为10 g/L，初始发酵pH 值为7.0，得到的累积气体产量如图7所示.相同情况下，以10 g/L 葡萄糖作为发酵基，接种10%菌液，发酵80 h，温度环境一致，产氢量如表1所示.

图7 发酵罐累积产气曲线

表1 P 菌在发酵罐和小样中产氢性能参数

在固定的实验条件下，将得到的发酵罐实验结果与前期220 mL 规模的小样实验结果进行对比，其气体产量、底物分解率及氢气质量分数的比较结果如图8所示.

图8 小样和发酵罐产氢参数对比

由图8(a)可见，恒定pH 值为7.0 的发酵罐实验具有最高的累积气体和氢气产量.pH 恒定为7.0 的发酵罐和小样实验均比未调控pH 情况下具有更高的产氢量.而2 组发酵罐实验氢气产量比同等控制参数下小样氢气产量高.未调控pH 条件下，发酵罐氢气产量为1.240 L/L，略高于小样氢气产量;调控pH 恒定时，发酵罐氢气产量为2.473 L/L，比小样提高了5%.由图8(b)中葡萄糖分解率对比可见，同样条件下发酵罐实验的葡萄糖分解率要低于小样实验的葡萄糖分解率，尤其在未调控pH 时，葡萄糖分解率差异更为明显.未调控pH时，发酵罐葡萄糖分解率仅为78.2%，与小样相差将近8%;调控pH 条件下，发酵罐葡萄糖分解率为95.2%，略低于小样葡萄糖分解率.由图8(c)中氢气质量分数对比可见，氢气的质量分数与葡萄糖分解率呈相反的变化，发酵罐实验所得到的气体组成中，氢气的质量分数明显增加，二氧化碳的质量分数降低.2 组发酵罐实验氢气的质量分数均达到60%以上，相比未调控pH 小样实验和调控pH 恒定的实验，氢气质量分数分别提高了1.73%和8.95%.

2.4 糖蜜基质浓度对产氢性能的影响

糖蜜是一种制糖工业废料，作为发酵底物，不但能够发酵产氢，而且有利于环保除废.在发酵罐单批次试验中，糖蜜的用量和添加时间都有可能对产氢量和产氢速率造成影响.糖蜜为微生物提供发酵产氢的原料并且帮助代谢生长，因此需要确定最佳糖蜜添加量，若底物浓度不足，会使微生物代谢缓慢、产氢率下降;底物浓度过高，会对微生物制氢产生抑制作用.当糖蜜浓度分别为20，30，35，40，50 g/L 时，按照10%比例接种P 菌至6 L 发酵罐培养基，所得产气量变化曲线如图9所示.

图9 不同糖蜜基质浓度对发酵产气的影响

由图9可知，随着糖蜜加入量从20 g/L 增加到35 g/L 时，每组试验产气效率逐步提高，并且产氢启动时间也由10 h 缩短到5 h 左右.而继续增加糖蜜用量，产氢效率反而降低.当糖蜜加入量达到50 g/L 时产气量显著降低，甚至低于糖蜜浓度30 g/L时的产气量，说明底物浓度过高确实对产氢菌有抑制作用.因此，确定培养基中糖蜜浓度为35 g/L时产气效率最佳，降低和提高糖蜜用量都会使产氢量下降.

3 结论

1)专性厌氧菌P 可用于发酵底物为葡萄糖的发酵制氢过程，其发酵制氢的最佳工艺条件是发酵底物葡萄糖的浓度为10 g/L，发酵时pH 值恒定为7.0，接种比例为10%.在此条件下，发酵罐气体总产量达到最大值.

2)恒定pH 值为7.0 的发酵罐实验具有最高的累积气体和氢气产量.每升培养基可产氢气2.473 L，比小样提高了5%;葡萄糖分解率达到95.2%，氢气的质量分数达到68.73%，相比未调控pH 实验结果均有显著提高.

3)选用糖蜜为底物发酵制氢有利于环保除废，确定培养基中的糖蜜浓度为35 g/L 时产气效率最佳.底物不足或者过量对微生物产氢的抑制作用较明显，因此降低和提高糖蜜用量都会使产氢量下降.

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