农杆菌介导的smt1富硒基因转化紫花苜蓿研究

李 晶，任卫波，郭慧琴，王茅雁，刘雅学

(1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018; 2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010)

硒是维持植物正常生理机能必需的微量元素之一[1]。在生物体内，硒主要参与合成硒蛋白，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的必要成分。适量的硒对维持GSH-Px酶活性，提高机体抗氧化能力具有重要作用[2]。然而，过量的硒能够对植物细胞产生毒害作用，主要归因于在含硫蛋白质或酶中，硒能够替代硫元素，从而导致该蛋白失去活性。

我国是一个贫硒的国家，刘金旭等[3]调查发现，我国近72%的草原区生产的牧草平均硒含量低于0.05 mg·kg-1，属于缺硒牧草，不能满足家畜生长对硒的需求。研究表明，饲用高硒苜蓿干草(硒含量是普通干草的8～10倍)后，奶牛体长、胸围和体质量显著增加，日产奶量提高8.6%，奶料比降低12.17%，乳脂含量提高22.15%[4]。通过遗传改良培养富硒苜蓿是提高苜蓿干草硒含量最经济有效的途径之一。

硒超富集植物二沟黄芪(Astragalusbisulcatus)在野生条件下，其茎叶中硒含量占到干质量的0.65%[5]，是理想的富硒基因来源。从该植物中能克隆到富硒/耐硒基因smt1(硒代半胱氨酸甲基转移酶基因)。Ellis等[5]将该基因转移到拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，获得超表达smt1基因的转基因植株，与野生型相比，转基因植株硒含量增加了6～8倍。因此，二沟黄芪smt1基因是利用遗传改良方法培育富硒苜蓿的首选。然而，目前国内有关二沟黄芪smt1基因在紫花苜蓿(Medicagosativa)中的遗传转化及超表达的相关研究较少。为此，本研究以国内广泛种植的紫花苜蓿品种“中苜1号”植株为受体材料，通过构建表达载体及农杆菌侵染，以期获得超表达smt1基因的转化植株，为富硒苜蓿新品种选育提供基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1受体材料 选取颗粒饱满的“中苜1号”种子(由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所杨青川老师提供)，经75%酒精浸泡1 min后，放入次氯酸钠浸泡10～20 min，然后用蒸馏水冲洗3～4次，将冲洗干净的种子放在滤纸上吸干，接种于固体培养基中(pH值6.0)。培养条件为25 ℃，光照强度2 500 lx，光/暗周期16 h/8 h，培养6～7 d，取苜蓿无菌苗的下胚轴，作为转化受体。

1.1.2smt1基因cDNA序列合成 二沟黄芪smt1基因cDNA序列信息从中NCBI获取，cDNA片段由大连宝生物TAKARA公司合成，合成后cDNA片段连接到克隆T载体，并转入重组质粒，低温保存备用。

1.2试验方法

1.2.1表达载体的构建 分别提取含有smt1基因cDNA片段的重组质粒和表达载体pCAMBIA1301的质粒。随后用EcoR I和BamH I进行酶切。酶切后，用DNA胶回收试剂盒分别回收pCAMBIA1301的大片段和重组克隆质粒的小片段，并去磷酸化，按照连接试剂盒的操作步骤进行连接获得重组质粒，随后利用重组质粒转化DH5α感受态细胞中，复苏1 h，均匀涂在加有卡纳霉素(Kan)的固体LB培养基上，37 ℃过夜培养，挑取白色单菌落，进行检测(图1)。

图1 质粒pCAMBIA1301图谱Fig.1 Construction of expression vector pCAMBIA1301-Absmt1

1.2.2农秆菌工程菌制备及检测 用北京天根公司生产的质粒试剂盒提取质粒，选取EcoR I和BamH I酶切位点，酶切体系如下：重组质粒5 μL，EcoR I和BamH I各1 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 9 μL，置于37 ℃培养2 h，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。利用热激法将正确的重组质粒转入农杆菌LBA4404中。 随机挑取4个转化菌落进行PCR扩增鉴定。 20 μL PCR反应体系包括10×PCR Buffer 1.5 μL，TransStart Taq (5 U·μL-1) 0.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1) 1.3 μL，引物(10 μmol·L-1)0.3 μL,菌液1 μL，ddH2O加至总体积20 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min,共35循环，72 ℃终止反应10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增引物序列：

P1:5′-ACATGATTACGAATTCATGTCGTC-GCCATTGATAAC-3′;

P2:5′-CGACTCTAGAGGATCCCTTTGCAG-AAAAAGTAGG-3′。

1.3农杆菌介导的遗传转化

1.3.1菌液的制备 挑取单菌落加入含有50 mg·L-1Kan和50 mg·L-1利福平(Rif)液体LB培养基中，置于28 ℃摇床中200 r·min-1培养12 h，当菌液OD值为0.5时停止培养。在超净工作台上吸取5 mL该菌液，加入无抗生素LB液体培养基中，28 ℃复苏1 h，离心富集菌体用于侵染。

1.3.2外植体的转化、继代和转化植株的获得 将生长6～7 d的无菌苗,用解剖刀将下胚轴切成3～4 mm 的小段,接种到预培养基本培养基上，暗培养2 d。取预培养的下胚轴浸泡已加入乙酰丁香酮(50 μmol·L-1)的农杆菌菌液中，轻轻摇动使下胚轴和农杆菌充分接触，处理5 min后，取出下胚轴，并用灭菌滤纸吸干表面菌液，置于共培养基中，黑暗培养2 d。用1/2 MS液体培养基中加入头孢霉素(100 mg·L-1)浸泡下胚轴5 min，用滤纸吸干表面液体置于筛选培养上，15 d继代一次，待愈伤完全形成后置于分化培养基中，15 d继代一次。待植株形成后放入1/2 MS培养基中进行生根培养获得完整转化植株，将植株移植到含有营养液的蛭石中继续培养。

1.4潮霉素抗性的筛选 外植体切取后，在诱导培养基上培养1周。随后，将其转入含有不同梯度潮霉素(Hyg)的筛选培养基中，15 d更换一次培养基，置于人工气候培养箱中培养，光照时间16 h。共设置0、3、6、9、12 mg·L-15个潮霉素梯度进行转化植株的筛选，每个梯度选取50个外植体，对诱导分化的外植体诱导率、褐化情况进行观测，确定最佳的筛选压条件。

1.5转基因植株检测 在获得的10个转化单株中，选取长势较好的5个单株，用植物基因组DNA提取试剂盒单株提取基因组DNA，进行PCR检测。随后用植物RNA提取试剂盒单株提取RNA，用Transgene反转录试剂盒(Transascrit Ⅱ First-strand cDNA synthesis Supermix)进行反转录，反应体系包括RNA 50～500 ng、2×TSII Reaction Mix 1 μL、TranaScrit Ⅱ RT Enzyme Mix 1 μL、 Rnase-free Water加到20 μL。 然后进行RT-PCR扩增。PCR反应循环包括94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延长2 min，共40个循环，循环结束后72 ℃延长10 min。

2 结果与分析

2.1表达载体的构建及转化农杆菌酶切检测 表达载体pCAMBIA1301-smt1经过双酶切，形成一大一小2个片段(图2)，其中小片段在1 000 bp左右，与smt1基因的cDNA片段大小吻合，这表明表达载体构建成功。菌落PCR检测结果表明，随机选取的4个转化菌落均扩增获得1 000 bp左右的片段，这表明4个菌落均为阳性重组质粒(图3)。

2.2潮霉素抗性筛选 潮霉素对苜蓿愈伤组织的形成有显著的抑制效应。当潮霉素质量浓度达到6 mg·L-1时，与未添加潮霉素相比，出愈率降低近90%。与此同时，随着潮霉素质量浓度的增加，玻璃化、褐化现象逐步严重，当潮霉素质量浓度为9和12 mg·L-1时，外植体全部出现褐化、玻璃化。因此，3 mg·L-1是潮霉素抗性筛选的最佳质量浓度。

2.3转化植株检测 基因组PCR检测结果表明，供试的10个转化植株中有5株能扩增出1 000 bp大小的特征条带，该条带与目的基因大小相符，初步表明目的基因已整合到紫花苜蓿基因组中(图4)。RT-PCR检测结果表明，5个转基因植株中的2株基因表达呈阳性，扩增出了与目的基因cDNA大小一致的片段，其他3个单株均未能扩增出目标条带(图5)。

图2 重组质粒双酶切电泳图Fig.2 PCR analysis of recombinant plasmid

图3 单菌落PCR扩增产物的鉴定Fig.3 PCR analysis of single colony of agrobacterium with recombinant plasmid

表1 不同浓度潮霉素对苜蓿愈伤组织形成的影响 Table 1 Effects of hygromycin concentration on formation of alfalfa callus

图4 转基因植株PCR检测鉴定Fig.4 PCR analysis of transgenic plants

图5 转化植株基因表达鉴定Fig.5 RT-PCR analysis of transgenic plants

3 讨论

硒作为重要的微量元素，不仅对苜蓿正常生长及其抗逆能力的提高具有重要作用，还可通过食物链，增加人类膳食中硒的水平，增强其抗癌能力[6]。然而，由于我国土壤中硒水平普遍比较低，要提高苜蓿饲草中硒水平，一方面要通过增施硒肥，提高硒供给水平，另一方面要通过遗传改良，培育富硒苜蓿品种。已有的研究[7]表明，增施硒肥虽然可以部分弥补硒缺乏，提高饲草产量和硒含量，但硒利用效率低，需要大量投入硒肥，这不仅成本高，而且容易造成土壤硒污染。因此,通过遗传改良，培育富硒新品种是经济、安全的提高硒含量的方法。

自然中存在一些硒超富集植物，二沟黄芪就是其中之一。Sors等[8]研究发现，在土壤硒含量为2.2 μg·g-1时，二沟黄芪茎叶硒可达94.4～96.3 μg·g-1，花序中硒质量浓度可达308.9～312.9 μg·g-1,其质量浓度是相同生境下其他黄芪属植物的30～100倍。进一步研究发现，二沟黄芪之所以能够超富集硒而不受硒毒害的影响，原因在于其体内的硒半胱氨酸甲基化转移酶(SMT,Selenocysteine Methytransferase)能将大部分硒代半胱氨酸(SeCys)高效转化为无毒害的硒-甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys，Se-methylselenocysteine)。最新研究发现，二沟黄芪smt1基因能够高效甲基化硒代半胱氨酸，可能是由一个丙氨酸到苏氨酸的点突变所致[8]。Ellis等[5]首次通过花粉滴管法将smt1基因成功转入拟南芥中，结果发现，与对照相比，转基因植株中硒含量可提高近8倍，并能合成甲基硒代半胱氨酸(Methylselenocysteine)，该氨基酸是野生型拟南芥植株不能合成的。这表明利用smt1基因进行遗传转化，培养富硒植株，并使其具备合成甲基硒代半胱氨酸能力是可行的。Ari等[9]以二沟黄芪smt基因的保守序列为模板，设计引物，成功地从A.chrysochlorus中克隆出编码硒半胱氨酸甲基化转移酶基因。

盛慧等[10]研究发现，6株PCR检测阳性植株进行基因表达检测时，有2株呈阳性，阳性率为33%。 本研究也有类似的发现，在5个PCR检测阳性植株中有2个植株检测到阳性表达，阳性率为40%。其原因可能是部分植株转化后，由于插入位点或插入位置的差异，引起了基因沉默。王鸣刚等[11]利用农杆菌EHA105将拟南芥螯合肽合成酶基因(AtPCS1)转入甘农1号紫花苜蓿，利用PCR随机检测9株转化株中，6株为阳性，阳性率为67%。此外，在利用同一转化体系将口蹄疫病毒抗原决定融合基因转入时，阳性检测率仅为57.1%[12]。这表明转化效率可能与转入基因片段有关。

4 结论

本研究通过双酶切，将人工合成的富硒基因smt1的cDNA片段连接到工程质粒pCAMBIA1301中，成功地构建了植物表达载体。通过农杆菌，将目的基因转入苜蓿外植体，并通过组培再生体系，成功获得转基因单株。通过PCR和RT-PCR检测，初步验证smt1基因已成功导入苜蓿基因组且能够正常表达，为下一步深入开展转基因植株表型性状鉴定及功能研究奠定基础。

[1] Zhu Y G,Elizabeth A H,Pilon S,etal.Selenium in higher plants: understanding mechanisms for biofortification and phytoremediation[J].Trend in Plant Science,2009,14(8):436-442.

[2] Nicoletta R,Flavia N L.Heavy metal hyperaccumulating plants: How and why do they do it? And what makes them so interesting [J].Plant Science,2011,180(2):169-181.

[3] 刘金旭，陆肇海，苏琪.家畜家禽的硒营养缺乏的调查研究Ⅰ.我国饲料牧草含硒量的分布(初报)[J].中国农业科学,1985(4):76-80.

[4] 郭孝，介晓磊，蒋世传，等.高微量元素苜蓿青干草在荷斯坦奶牛生产中应用效果的分析[J].中国牛业科学,2008,34(5):54-57.

[5] Ellis D R,Thomas G S,Dennis G B,etal.Production of Se-methylselenocysteine in transgenic plants expressing selenocysteine methyltransferase[J].BMC Plant Biology,2004,4(1):1-11.

[6] Dong Y,Lisk D,Block E,etal.Characterization of the biological activity of gamma-glutamyl-Se-methylselenocysteine:A novel,naturally occurring anticancer agent from garlic[J].Cancer Research,2001,61:2923-2928.

[7] 刘世亮,马闯,介晓磊,等.喷施亚硒酸钠对紫花苜蓿干草产量和品质的影响[J].草业科学,2008,25(8):73-78.

[8] Sors T G,Martin C P,Salt D E.Characterization of selenocysteine methyltransferases fromAstragalusspecies with contrasting selenium accumulation capacity[J].The Plant Journal,2009, 59:110-122.

[9] Ari S,Cakir O,Neslihan T K.Selenium tolerance inAstragaluschrysochlorusidentification of a cDNA fragment encoding a putative selenocysteine methyltransferase[J].Acta Physiologiae Plantarum,2010,32(6):1085-1092.

[10] 盛慧，朱延明，李杰，等.DREB2A基因对苜蓿遗传转化的研究[J].草业科学,2007,24(3):40-45.

[11] 王鸣刚,骆换涛,李志忠，等.AtPCS1基因表达载体构建与转化苜蓿的研究[J].草业科学,2011,28(2):201-206.

[12] 王鸣刚，罗茂春，彭轶楠，等.口蹄疫病毒抗原决定簇融合基因转化苜蓿[J].草业科学,2011,28(8):1546-1551.