平喘颗粒剂对哮喘豚鼠气道炎症及重塑的影响

徐婧 韩迪 许宏连 李燕 指导 杨质秀

（黑龙江省中医研究院 ·哈尔滨 150001）

平喘颗粒剂对哮喘豚鼠气道炎症及重塑的影响

徐婧 韩迪 许宏连 李燕 指导 杨质秀

（黑龙江省中医研究院 ·哈尔滨 150001）

目的：观察平喘颗粒对哮喘豚鼠气道炎症和重塑的影响。方法：将60豚鼠（雌雄兼用）随机分为5组，即空白组、模型组、阳性对照药（醋酸泼尼松）组和平喘颗粒高、低剂量组。除空白组外，其余4组用超声雾化器射1%磷酸组胺、0.2%氯化乙酰胆碱的等量混合液复制豚鼠哮喘模型。取肺组织进行HE染色，光镜下观察豚鼠肺组织病理学变化，并进行免疫组化染色，观察豚鼠肺组织NF-KB、a-SMA表达的变化。结果：平喘颗粒组和阳性对照药组NF-KB、a-SMA的表达较模型组明显降低（P<0.05）;而平喘颗粒各剂量组有不同程度的降低，以高剂量组最为明显;平喘颗粒各剂量组较阳性药对照组有所降低（P<0.05）。结论：平喘颗粒可以有效地抑制实验性哮喘豚鼠气道炎症和重塑。

平喘颗粒 哮喘 NF-KB;a-SMA HE染色 免疫组织化学

支气管哮喘是一种由多种炎症细胞和炎性介质引起，以呼吸道高反应性为特征的变态反应性疾病。早期病变以小气道炎症为主，长期气道炎症导致气道重塑是支气管哮喘的严重后果。控制气道炎症和防治气道重塑是是哮喘防治的关键。本实验通过观察平喘颗粒对哮喘豚鼠气道炎症及重塑的影响，以明确其对支气管哮喘的治疗作用。

1 材料

1.1 动物

试验用豚鼠60只，雌雄兼用，体重150～200g。由吉林大学实验动物中心提供。

1.2 主要药品与试剂

平喘颗粒剂由麻黄、射干、白果、莱菔子、地龙等组成经粉碎过200目筛，水溶制成。磷酸组胺，惠世生化试剂有限公司，上海，批号：070308。氯化乙酰胆碱，上海三爱思试剂有限公司，批号：40061130。醋酸泼尼松片，天津太平洋制药有限公司生产，批号：H20040205。兔抗人NF-KB免疫组化多克隆抗体，批号：100622531A，福州迈新生物技术有限公司。鼠抗人a-SMA单克隆抗体，批号：100505403B，福州迈新生物技术有限公司。即用快捷型酶标羊抗鼠/兔LgG聚合物试剂盒，批号：1005054007D，福州迈新生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 哮喘豚鼠模型的制备及分组

造模参照文献[1]并稍作修改。操作具体如下∶试验用豚鼠60只，雌雄兼用，体重150-200g。随机分为空白组12只，哮喘组48只，然后将哮喘组放入密闭的玻璃钟罩内，用超声雾化器喷射1%磷酸组胺、0.2%氯化乙酰胆碱的等量混合液15-20s，喷雾停止后观察6min内豚鼠出现抽搐跌倒的时间，并记录从喷雾开始到抽搐，跌倒的时间，称引喘潜伏期。若引喘潜伏期大于120s者作为不敏感而落选。挑选合格者按体重随机分为四组：模型组、阳性对照药组、平喘颗粒高剂量组和平喘颗粒低剂量组。次日对哮喘豚鼠灌胃给药（1）平喘颗粒剂组：按2g/kg.d,8g/kg.d灌胃，（2）醋酸泼尼松组：按0.00073g/kg.d灌胃，（3）模型组：给予生理盐水灌胃，再雾化引喘，每周一次，每次5min，连续4周。空白组采用生理盐水进行雾化吸入。各组豚鼠在最后一天雾化吸入后处死，取肺组织进行免疫组化分析。

2.2 检测指标及方法

NF-KB、a-SMA测定 采用免疫组化法，按即用型快捷免疫组化MaxVision试剂盒提供的方法操作。结果应用图像分析系统，每张切片在高倍视野（x400）下随机选取5个视野，测定每个视野中阳性细胞中阳性颗粒的平均光密度值（A值）,A值越大阳性表达水平越高。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 NF-KB、a-SMA免疫组化测定结果

NF-KB、a-SMA在模型组、平喘颗粒组及阳性药对照组均有表达，空白组弱阳性表达，各组与空白组差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组NF-KB、a-SMA的表达较平喘颗粒组及阳性药对照组明显增强（P＜0.01），平喘颗粒高剂量组NF-KB、a-SMA的表达较阳性对照药组降低（P＜0.05），而平喘颗粒低剂量组与阳性对照药组相比无显著性差异（P＞0.05）见表1。

3.2 肺组织病理学观察

HE染色显示：空白组豚鼠支气管和肺泡结构正常；模型组气道上皮坏死脱落，气道平滑肌层和网状基底膜层增厚，粘膜下及管壁周围有大量炎症细胞侵润，气道壁增厚，官腔狭窄，有时可见黏液栓堵塞；平喘颗粒组及醋酸泼尼松组较模型组明显减轻，但平喘颗粒低剂量组与醋酸泼尼松组无明显差别，高剂量组较其减轻。

表1 各组豚鼠肺组织NF-KB、a-SMA测定结果的比较（A值，±s,n=12）

表1 各组豚鼠肺组织NF-KB、a-SMA测定结果的比较（A值，±s,n=12）

注：NF-KB、a-SMA,与空白组比较，*P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.01;平喘颗粒高剂量组与醋酸泼尼松组比较，ΔP＜0.05；

组别 NF-KB a-SMA空白组 0.17±0.02 0.22±0.03模型组 0.34±0.06* 0.63±0.07*平喘颗粒中组 0.28±0.03*# 0.45±0.08*#平喘颗粒高组 0.24±0.06*#Δ 0.37±0.05*#Δ醋酸泼尼松组 0.31±0.07*# 0.49±0.07*#

4 讨论

既往哮喘的研究过多地关注哮喘炎症反应的控制，由于哮喘发病机制异常复杂，所以炎症的控制也异常困难，现代医学在这方面的研究已经多年没有突破性进展。从近几年中医药治疗哮喘的研究文献中可以看出，中医药具有不良反应小，不产生耐药性和依赖性，临床疗效肯定等优点。所以，利用祖国医学的辨证论治，寻求有效的治疗有十分重要的意义。祖国医学认为，支气管哮喘属于哮症范畴，杨质秀教授根据支气管哮喘的病因病机及发病的特点，继承前人又经二十年的临床经验，最终研制出平喘颗粒这一治疗支气管哮喘的制剂。本方证乃因感受风寒之邪，触动宿痰伏饮，痰随气升，气因痰阻，相互搏结，壅塞气道，肺失宣降，而致痰鸣如吼，气息喘促。治当宣肺化痰，降逆平喘。平喘颗粒剂的药物有射干、麻黄、白果、厚朴等中药组成。

近来研究表明，参与哮喘气道炎症过程的细胞因子、炎症递质在基因转绿水平上均受NF-KB调控[2,3]。Barnes[4]研究发现哮喘患者支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞及粘膜下细胞NF-KB活性增高，提出通过影响NF-KB的活化可能是治疗哮喘的一个心策略。长期的气道炎症导致气道重塑，气道重塑作为慢性哮喘的核心病理改变，是影响慢性哮喘患者生活质量和劳动能力的重要因素。气道平滑肌是起到重塑过程中的核心的病理改变。而气道a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）作为平滑肌的特征性标记物[6]，所以有效控制a-SMA，对预防气道重塑有重大意义。a-SMA的合成受NF-KB的调控，所以，抑制NF-KB的活化显得更加重要。本实验以超声雾化器射1%磷酸组胺、0.2%氯化乙酰胆碱的等量混合液复制豚鼠哮喘模型，来观察平喘颗粒在哮喘的发生发展过程中对NF-KB、a-SMA表达的影响，来明确中药对哮喘的防治作用。

本实验结果表明：模型组气道上皮坏死脱落，气道平滑肌层和网状基底膜层增厚，粘膜下及管壁周围有大量炎症细胞侵润，气道壁增厚，官腔狭窄，有时可见黏液栓堵塞；平喘颗粒组较模型组明显减轻。平喘颗粒组的NF-KB、a-SMA的表达明显降低，能够起到控制哮喘的作用。

［1］李仪奎.中药药理实验方法学[S].第二版。

［2］Cromwell O,Hamid Q,Corrigan CJ,et al. Expression and qeneration of interleukin-8,IL-6 and granuloytc-macrophage colcny-stimulsting factor by bronchial epithelial cells and enhanceuent by IL-1 beta and tunour necrosis factor-alphl[J]。Immunology,1992,77(3)∶330-337.

［3］Blackwell TS, Christmall JW.The role of neclear factorkappa B ineytokine gene regulation[J].Am J Respir cell Mol Biol,1997,17(1)∶3-9.

［4］Barnes PJ,Adcock IM. NF-kappa B∶ aprvotal role in asthma and a new targt for therapy[J] .Trends pharmacol Sci,1997,18(2)∶46-50.

［5］Shama RA, Gescher AJ,Steward WP.Curcum in the story so far[J].Eur J Cancer,2005,41(13)∶195-196.

［6］Schmid M, Sun G,Stacey MA,et al. Identification of Circulsting fibrocytes as precursors of bronchial myofibrolasts in asthma[J]. J Immunol,2003,171(1)∶380-389.

（2012-04-16 收稿）