甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因的分子变异

王晓华， 张振臣，2＊， 乔 奇，2， 秦艳红，2， 张德胜，2， 田雨婷，2

（1．河南省农业科学院植物保护研究所，郑州 450002； 2．河南省农作物病虫害防治重点实验室，郑州 450002）

甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato f eather y mottle vir us，SPFMV）是侵染甘薯的主要病毒之一，分布于世界各甘薯产区。SPFMV属于马铃薯Y病毒属（Potyvir us），基因组为单链正义RNA，可经蚜虫、摩擦和嫁接方式传播［1］。SPF MV可与甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chl or otic stunt vir us，SPCSV）协生共侵染甘薯引起SPVD（sweet potato vir us disease），SPVD是甘薯上的一种毁灭性病害。甘薯感染SPVD后，减产可达50%～98%，甚至绝收［2］。根据SPFMV外壳蛋白（coat protein，CP）基因的核苷酸序列以及在甘薯和鉴别寄主上的症状类型，SPFMV至少可划分为RC、O、C和EA 4个株系［3］。目前，侵染我国甘薯的SPFMV的分子变异及株系类型尚未见报道。单链构象多态性（single－strand confor mation poly morphis m，SSCP）分析技术是基于PCR、以构象为基础检测基因组中核苷酸变异的方法，已应用于植物病毒分子变异研究［4］。本研究以采自我国主要甘薯产区11个省份的病毒样品为材料，应用SSCP技术结合核苷酸序列测定的方法，对SPFMV CP基因的分子变异情况进行了分析，初步明确了这些地域的SPFMV的株系类型，可为该病毒的预警和控制提供参考和依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 病毒样品的采集

2009－2010年，分别从我国11个省（市）采集了50份具有典型病毒病症状的甘薯植株样品（表1），样品采回后种植于防虫温室内，成活后嫁接于健康巴西牵牛植株上。取甘薯叶片或对应嫁接发病的巴西牵牛叶片作为供试样品。

表1 不同分离物的SSCP图谱类型及其数目

1．1．2 酶及试剂（盒）

Flash UNIQ－10柱式 总 RNA 抽提 试剂盒、IPTG、氨苄青霉素（Amp）、X－gal、丙烯酰胺、溴酚蓝、N，N′－亚甲基双丙烯酰胺、硼酸和过硫酸铵均购自上海生工生物工程有限公司；去离子甲酰胺、二甲苯氰FF、Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Mar ker、RT－PCR试剂盒（Ta Ka Ra RNA PCR Kit，A MV Ver．3．0）和p MD19－T载体购自 Ta Ka Ra公司；大肠杆菌（Escherichia coli）J M109系本实验室保存；DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；质粒提取试剂盒为北京百泰克生物技术有限公司产品；其他试剂为国产分析纯试剂。

1．2 方法

1．2．1 引物设计

根据GenBank中登录的SPFMV核苷酸序列，设计一 对 简 并 引 物 P5（5′－TATGAC （A／G）CACTTCAGTGACGTTGCTGA－3′）和 P3（5′－GACTCTCGAGCCTATTGCACACCCCT CATTCC－3′），用于扩增SPFMV的CP基因片段，引物由上海生工生物工程有限公司合成。目的片段大小为328 bp。

1．2．2 RT－PCR

利用上海生工生物工程有限公司的Flash UNIQ－10柱式总RNA抽提试剂盒提取感病叶片的总RNA。以提取病叶总RNA为模板，利用P5和P3引物以及Ta Ka Ra公司的RT－PCR试剂盒（Ta Ka Ra RNA PCR Kit，AMV Ver．3．0）进行反转录和PCR，方法参照试剂盒说明书。PCR扩增条件为：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环。1．0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1．2．3 SSCP分析

SSCP分析参考魏太云等［5］的方法。取PCR产物2μL，加8μL上样缓冲液（95%去离子甲酰胺、0．5%溴酚蓝、0．5%二甲苯氰FF），混匀后在95℃中变性10 min，取出后立即冰浴5 min，然后全部上样于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶二甲叉双丙烯酰胺＝30∶0．8）。在4℃冰箱中电泳，首先在200 V电压下电泳5 min，然后100 V恒压电泳3 h，EB染色30 min观察结果。

1．2．4 PCR产物的克隆和序列测定

将纯化后的PCR产物与p MD19－T载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。核苷酸序列测定由Ta Ka Ra公司完成。利用DNA MAN和MEGA4．0软件对所测序列进行比较分析。

2 结果与分析

2．1 SPFMV CP基因的SSCP分析

从供试的50份样品中均扩增出了目的条带，SSCP分析结果表明，分析的各分离物至少有9种图谱类型（图1）。大多数样品集中分布在3种图谱类型中，其中有15个样品表现为图谱类型A，12个样品表现为图谱类型B，11个样品表现为图谱类型D，其他样品显示另外6种SSCP图谱类型（表1）。根据图谱条带的带形分布可大致分为4组，其中A、C、I为第1组（groupⅠ），B、E、F、H 为第2组（groupⅡ），D为第3组（groupⅢ），G为第4组（groupⅣ）。

图1 SPFMV不同分离物CP基因RT－PCR产物的SSCP分析

2．2 SPFMV不同分离物CP基因的序列分析

对显示不同带型的部分样品的CP基因进行了克隆和序列测定（表2），共测定了20个分离物的CP基因，结果表明，不同分离物CP基因的核苷酸序列一致性为77．2%～99．9%，说明侵染我国甘薯的SPFMV的CP基因存在较大的分子变异。选取Gen Bank中登录的SPFMV 4个株系（O、C、EA和RC）有代表性的核苷酸序列，与本研究测定的序列进行进化树分析（图2），发现20个分离物也明显分为4个组，与SSCP的分析结果基本一致，说明我国的SPFMV至少存在4个不同的株系类型。

表2 用于进化树分析的病毒样品及其SSCP图谱类型

图2 不同SPFMV分离物CP基因的进化树分析

3 讨论

本文利用PCR－SSCP的方法研究了我国甘薯主产区11个省份的SPFMV的分子变异和株系分化情况。SSCP分析结果表明，不同地区的分离物表现较丰富的图谱类型，说明各分离物之间存在序列差异。核苷酸序列测定结果证明了不同分离物CP基因的核苷酸序列一致性为77．2%～99．9%，根据Potyvir us病毒划分种的标准，当CP基因的核苷酸序列一致性高于76%时，应归为同一个种［6］，显然，这些不同地区的分离物均为SPF MV。根据CP基因核苷酸序列的进化树分析可以发现，SPF MV存在4个明显不同的株系，这是我国关于SPFMV株系研究的首次报道。对比序列测定结果和SSCP分析结果发现，病毒RNA序列差异与SSCP图谱之间并没有简单对应关系，例如，分离物Jiangsu－4与Henan－1的图谱类型相似，同属第2组，但两个分离物CP基因的核苷酸序列一致性仅为78．0%，分别属于C株系和EA株系；相反，分离物Anhui－1与Jiangsu－4为同一株系，但两者的SSCP图谱又不相同，说明SSCP并不能完全保证对不同分离物序列之间微小差异的检测［7］，精确的分子变异分析，需要核苷酸序列测定进行验证。

［1］ 张振臣，李大伟，陈健夫，等．甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备［J］．农业生物技术学报，2000，8（2）：177－179．

［2］ Gutiérrez，D L，Fuentes S，Salazar L F．Sweet potato vir us disease（SPVD）：Distribution，incidence，and effecton sweet potato yield in Per u［J］．Plant Disease，2003，87：297－302．

［3］ Ya masaki S，Sakai J，Fuji S，et al．Co mparisons a mong isolates of Sweet potato f eather y mottle vir us using complete geno mic RNA sequences［J］．Arch Vir ol，2010，155：795－800．

［4］ 魏太云，林含新，吴祖建，等．PCR－SSCP技术在植物病毒学上的应用［J］．福建农业大学学报，2000，29（2）：181－186．

［5］ 魏太云，林含新，吴祖建，等．水稻条纹叶枯病毒NS2基因遗传多样性分析［J］．中国生物化学与分子生物学报，2003，19（5）：600－605．

［6］ Untiver os M，Fuentes S，Kreuze J．Molecular variability of Sweet potato f eather y mottle vir us and other potyvir uses infecting sweet potato in Peru［J］．Arch Virol，2008，153：473－483．

［7］ 施农农，陈剑平，Ada ms M J．中国大麦黄花叶病毒分离物的分子变异［J］．病毒学报，1999，15（4）：339－347．