以D-果糖为原料利用新型异构酶转化生产D-阿洛糖

柏玮，朱玥明，门燕，李晓波，何森健，孙媛霞

天津工业生物技术研究所 工业酶国家工程实验室，天津 300308

在碳水化合物研究领域中，稀少糖是一类重要的研究内容。国际糖协会 (ISRS) 对稀少糖(Rare sugar) 的定义为“在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”[1]。这类糖大多可作为一种低热量、低吸收的甜味剂，并具有独特的生理学功能，在膳食、保健、医药等领域中发挥着非常重要的功能。例如，D-阿洛酮糖可以改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等[2-4]，D-阿洛糖具有抑制活性氧、抑制癌细胞增殖等功能等[5]。

日本的研究学者Izumori[6]于2002年建立了稀少糖的生物转化生产策略，即Izumoring方法。该方法中利用酮糖差相异构酶 (Ketose epimerase)、醛糖异构酶 (Aldose isomerases) 和多元醇脱氢酶 (Poly dehydrogenase) 进行所有单糖及糖醇之间的相互转化。该策略提示给我们一种利用生物转化生产稀少糖的方法，即利用天然植物成分或食品工业中加工副产物淀粉、乳糖为原料经过现有成熟工艺获得木糖、果糖、半乳糖，再通过各种酶的作用获得稀少糖。在 Izumoring策略中，以天然原料为切入点，有一条关键的切入途径。即：淀粉→果糖→D-阿洛酮糖。

D-阿洛酮糖是 D-果糖的 C-3差相异构体。生物催化转化D-果糖生产D-阿洛酮糖，可以利用的酶包括：D-塔格糖-3-差相异构酶(D-tagatose 3-epimerase，缩写为 DTE) 和D-阿洛酮糖-3-差相异构酶 (D-psicose 3-epimerase，缩写为DPE)[7-9]。其中，DTE的最适底物是D-塔格糖，而DPE则在底物是D-阿洛酮糖时发挥最大的催化活力。目前为止被发现并表征的D-阿洛酮糖生产酶只有两种DTE[7,15]和两种DPE[8,14]。通过比对发现，来源于C. cellulolyticum H10的DPE基因与已经发现的根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens的DPE基因具有60%的相似性。因此，C. cellulolyticum DPE有潜力成为生产D-阿洛酮糖的第5种C-3-差相异构酶。

D-阿洛酮糖与 D-阿洛糖之间的相互转化，是一个醛酮异构反应。1998年，Bhuivan等首次利用基因工程获得的假单胞菌 Pseudomonas stutzeri的 L-鼠李糖异构酶 (L-rhamnose isomerase，缩写为 L-RhI) 进行酶固定化和循环转化生产 D-阿洛糖。将 L-RhI固定在壳聚糖BCW-2603珠载体上，加入20% D-阿洛酮糖溶液在40 ℃条件下进行反应，最终约40%转化为D-阿洛糖[10]。然而，L-RhI的最适底物并不是D-阿洛酮糖，而是 L-鼠李糖。大部分的 L-RhI因此并不具备催化生产 D-阿洛糖的能力，比如Escherichia coli L-RhI[11]、苍白芽胞杆菌Bacillus halodurans L-RhI[12]以及海栖热袍菌Thermotoga maritime L-RhI[13]。开发新的L-RhI，并研究不同来源的L-RhI催化生产D-阿洛糖的机理，因此变成一个十分有趣的课题。

本文克隆了来源于C. cellulolyticum H10的DPE基因以及来源于 Bacillus subtilis 168的L-RhI基因，并分别使其在宿主菌 B. subtilis及E. coli BL21 (DE3) 中得到了表达。接着，对表达后的DPE及L-RhI进行了纯化。最后对两种重组蛋白的催化转化能力进行了试验。打通了以D-果糖为原料转化生产 D-阿洛酮糖，最后得到D-阿洛糖的工艺路径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生化试剂

D-果糖、D-阿洛酮糖、D-塔格糖、D-山梨糖、D-阿洛糖等稀少糖均为分析纯试剂，购自Sigma Aldrich。蛋白胨、酵母粉、琼脂及其他试剂均为分析纯。

1.1.2 菌种与质粒

对于DPE基因的克隆来说，质粒与宿主菌分别为pMA5 (2) 及B. subtilis WB600。

对于L-RhI基因的克隆来说，质粒与宿主菌分别为pET-21a (+) 与E. coli BL21 (DE3)。

B. subtilis及 E. coli的培养基都是 Luria–Bertani (LB) 培养基。

1.2 方法

1.2.1 DPE基因在B. subtilis中的克隆与表达

根据C. cellulolyticum H10的DPE基因序列设计引物：上游引物pDPEF和下游引物pDPER。上下游引5¢端分别引入Nde Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点 (表1)。并在C端插入了一段6×His标签，以简化其纯化步骤。

DPE的PCR基因片段和表达载体pMA5用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ进行酶切反应。回收后的目的片段与载体用 T4 DNA连接酶连接，连接产物pMA-DPE转化至B. subtilis WB600中进行克隆，PCR筛选阳性克隆，并用双酶切鉴定，挑取阳性转化子。

插入 pMA-DPE 的重组菌接入 LB-kanamycin培养基 (kanamycin终浓度50 mg/L)中，37 ℃、200 r/min培养16 h。

1.2.2 重组DPE蛋白的纯化

来源于C. cellulolyticum H10的DPE基因通过基因重组在B. subtilis WB600中表达，经过3个步骤对表达产物进行分离纯化，最终达到了电泳纯：

1) 粗提取：离心收集重组菌10 min (4 ℃，6 000×g)，弃去上清，并用ddH2O洗涤菌体2次，离心20 min (4 ℃，12 000 r/min)，弃去上清，用破碎缓冲液 (25 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑，pH 8.0) 悬浮，并在冰上超声破碎细胞，离心20 min (12 000 r/min，4 ℃)。

表1 PCR引物列表Table 1 PCR primers used in this study

2) 镍离子亲和层析：将上步所得离心上清经0.45 μm的膜过滤后，上样His-Trap镍离子螯合柱(平衡缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH 8.0)，以高咪唑含量的缓冲液进行线性洗脱 (25 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0)。收集目的蛋白。

3) 离子交换色谱：将上步所得溶液经超滤脱盐后，上样 Source 15Q阴离子交换柱 (GE Healthcare Biosciences) (平衡缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 6.5)，以高NaCl浓度的缓冲液进行线性洗脱 (20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 6.5)。收集目的蛋白洗脱峰。

最后用20 mmol/L HEPES (pH 8.0) 的缓冲液将酶溶液超滤脱盐，并低温保存。

1.2.3 L-RhI基因在E. coli BL21中的克隆与表达

根据B. subtilis 168的L-RhI基因序列设计引物：上游引物pRHIF 和下游引物pRHIR。上下游引物5¢端分别引入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点。并在C端插入了一段6×His标签，以简化其纯化步骤。

L-RhI的PCR基因片段和表达载体pET-21a (+) 用限制性内切酶BamHⅠ和 XhoⅠ进行酶切反应。回收后的目的片段与载体用T4 DNA连接酶连接，连接产物pET-21a-L-RhI转化至E. coli DH5α感受态中进行克隆，PCR筛选阳性克隆，并用双酶切鉴定，挑取阳性转化子转入E. coli BL21进行诱导表达。

插入 pET-21a-L-RhI的重组菌接入 LB-ampicillin培养基 (ampicillin终浓度 100 mg/L)中，37 ℃、200 r/min培养16 h。

1.2.4 重组L-RhI蛋白的纯化

经过3个步骤对重组L-RhI表达产物进行分离纯化，最终达到了电泳纯：

1) 粗提取：离心收集重组菌10 min (4 ℃，6 000×g)，弃去上清，并用ddH2O洗涤菌体2次，离心20 min (4 ℃，12 000 r/min)，弃去上清，用破碎缓冲液 (20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，0.5%甘油，pH 8.0) 悬浮，并在冰上超声破碎细胞，离心20 min (12 000 r/min，4 ℃)。

2) 镍离子亲和层析：将上步所得离心上清经0.45 μm的膜过滤后，上样 His-Trap镍离子螯合柱 (平衡缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，0.5%甘油，pH 8.0)，以高咪唑含量的缓冲液进行线性洗脱 (20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，0.5%甘油，200 mmol/L咪唑pH 8.0)。收集目的蛋白。

3) 离子交换色谱：将上步所得溶液经超滤脱盐后，上样DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱 (GE Healthcare Biosciences) (平衡缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 6.0)，以高NaCl浓度的缓冲液进行线性洗脱 (20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 6.0)。收集目的蛋白洗脱峰。

最后用50 mmol/L Glycine-NaOH (pH 9.0)的缓冲液将酶溶液超滤脱盐，并低温保存。

本文所有纯化步骤所用系统均为 ÄKTA PurifierTM 100 (GE Healthcare Biosciences)。

1.2.5 DPE催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖

底物溶液的配制：在 20 mmol/L HEPE (pH 8.0) 的缓冲液中，加入 D-果糖，配成终浓度10 g/L的溶液。

在500 μL的底物溶液中加入2.5 μg纯化后的DPE，于50 ℃的金属浴中反应。在100 ℃的沸水浴中加热5 min终止反应。

1.2.6 L-RhI催化D-阿洛酮糖转化为D-阿洛糖

底物溶液的配制：在50 mmol/L Glycine- NaOH (pH 9.0) 的缓冲液中，加入1 mmol/L MnCl2，再加入D-阿洛酮糖，配成终浓度10 g/L的溶液。

在1 mL的底物溶液中加入49.0 μg纯化后的L-RhI酶液，于 60 ℃的金属浴中反应。终止反应时加入100 μL三氯乙酸 (10%)。

1.2.7 糖的检测

仪器为安捷伦高效液相色谱仪 1200，分析柱：安捷伦 Zorbax 糖分析柱，流动相：75%乙腈 (以D-果糖为底物生成D-阿洛酮糖) 或78%乙腈 (以D-阿洛酮糖为底物生成D-阿洛糖)，流速：1 mL/min，柱温：30 ℃，检测器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D-果糖、D-阿洛酮糖和 D-阿洛糖纯品为标准品，将上例得到的样品进行分析，上样量为5 μL。

2 结果与分析

2.1 DPE基因的表达与纯化

已有研究报道了来源于 C. cellulolyticum H10的DPE基因在E. coli中的表达[11]。然而结果表明，DPE在E. coli中的表达量有限，并且表达产物大部分是包涵体，不能直接用于糖反应。这对DPE基因的表达体系提出了一个新的挑战。用枯草芽胞杆菌作宿主菌，有以下几个优点：1) 枯草芽胞杆菌表达体系不需要诱导物的加入，一方面节约了成本，另一方面免去某些诱导物对人体的毒害；2) 利用枯草芽胞杆菌，可以构建分泌型的表达系统，将目的蛋白分泌到细胞外部，从而不再需要细胞的破碎步骤，简化了操作流程；3) 枯草芽胞杆菌是革兰氏阳性细菌，其细胞膜不均有内毒素，对人体无害，是一种公认的食品级微生物。

本文以枯草芽胞杆菌为宿主菌，对DPE基因进行了表达。由于DPE基因在组成型表达启动子HpaⅡ的调控之下，故不需要外源诱导物的加入。如图1所示，与空载体对照，有明显的目的蛋白条带 (33 kDa)，且有大量的可溶性蛋白。

图1 DPE基因在B. subtilis中表达的SDS-PAGE结果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of DPE expressed in B. subtilis. M: protein marker; 1: total cell lysate obtained from a non-expression control of B. subtilis transformed with pMA5; 2: total cell lysate obtained from B. subtilis transformed with pMA5-DPE; 3: the soluble supernatant of B. subtilis transformed with pMA5; 4: the soluble supernatant of B. subtilis transformed with pMA5-DPE.

重组DPE蛋白经过His TrapHP亲和色谱以及Source15Q阴离子交换色谱之后，纯度达到了电泳纯，如图2所示。重组DPE蛋白的理论分子量约 33 kDa，聚丙烯酰胺凝胶电泳 (12% SDS-PAGE) 的结果显示，目的蛋白条带大小符合预期。

2.2 L-RhI基因的表达与纯化

将空载体pET-21a (+) 转化到E. coli BL21中，作为对照与B. subtilis pET-21a-L-RhI同批培养并诱导表达。由图 3可知，经 IPTG诱导，pET-21a-L-RhI有明显的目的蛋白条带 (49 kDa)。将菌体破碎后，分别取上清及沉淀进行蛋白电泳后发现，表达产物大量为可溶性蛋白，包涵体较少。

重组L-RhI蛋白经过His TrapHP亲和色谱以及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱之后，纯度达到了电泳纯，如图4所示。重组DPE蛋白的理论分子量约49 kDa，聚丙烯酰胺凝胶电泳 (12% SDS-PAGE) 的结果显示，目的蛋白条带大小符合预期。

图2 重组DPE蛋白的纯化Fig. 2 Purification of the recombinant DPE expressed in B. subtilis. M: protein marker; 1: the soluble supernatant of B. subtilis transformed with pMA5-DPE; 2: recombinant DPE purified through Ni column; 3: recombinant DPE purified through Source 15Q column.

图3 L-RhI基因在E. coli中表达的SDS-PAGE结果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of DPE expressed in E. coli. M: protein marker; 1: total cell lysate obtained from a non-expression control of E. coli BL21 transformed with pET-21a (+); 2: total cell lysate obtained from E. coli BL21 transformed with pET-21a-L-RhI; 3: the soluble supernatant of E. coli BL21 transformed with pET-21a-L-RhI; 4: the inclusion body of E. coli BL21 transformed with pET-21a-L-RhI.

图4 重组L-RhI蛋白的纯化Fig. 4 Purification of the recombinant L-RhI expressed in E. coli. M: protein markers; 1: the soluble supernatant of E. coli transformed with pET-21a-L-RhI; 2: recombinant L-RhI purified through Ni column; 3: recombinant L-RhI purified through DEAE Sepharose Fast Flow column.

2.3 以D-果糖为底物催化生产D-阿洛糖

D-阿洛酮糖是 D-果糖的 C-3差相异构体。D-阿洛糖与D-阿洛酮糖互为醛酮异构体。从D-果糖到 D-阿洛糖的转化，需经过两步异构化反应 (图5)。自从2002年Izumoring策略揭示出了以廉价的果糖生产 D-阿洛糖的可能性，许多的研究都致力于找到合适的异构酶来完成这两步转化反应。

图5 D-果糖、D-阿洛酮糖与 D-阿洛糖间的转化方程式Fig. 5 Reaction scheme among D-fructose, D-psicose and D-allose.

2.3.1 DPE催化D-果糖生产D-阿洛酮糖

来源于C. cellulolyticum H10的DPE具备催化生产D-阿洛酮糖的催化活力 (图6)。在50 ℃反应1 h后，反应即达到了平衡。此时，D-果糖的转化率为 27.34%。本文还试验了大批量地生产D-阿洛酮糖，在底物溶液中加入了500 g/L的 D-果糖，反应的最终转化率也可以达到24.83%。

实验证明，重组C. cellulolyticum DPE适用于 D-阿洛酮糖的生产。其一，其催化反应速率高，能短时间达到反应平衡；其二，其表达宿主菌是枯草芽胞杆菌，符合食品生产的安全需求。

图6 以D-果糖为底物反应1 h后反应液的液相色谱图Fig. 6 HPLC of the reactants after 1 hour’s reaction using D-fructose as the substrate.

图7 催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的反应过程曲线Fig. 7 Bioconversion of D-fructose into D-psicose using the purified DPE.

2.3.2 L-RhI催化D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖

L-RhI是一种醛酮异构酸，它可以催化D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖。但不是所有来源的L-RhI都具备这种催化活力，它的最适底物是 L-鼠李糖。目前为止，以D-阿洛酮糖为底物生产D-阿洛糖的L-RhI都源自假单胞菌P. stutzeri。

来源于 B. subtilis 168的 L-RhI (GenBank Accession No. AL009126.3) 与P. stutzeri L-RhI (GenBank Accession No. AB121136.1) 的氨基序列相似度不高，只有 17.23%。然而，实验结果发现，B. subtilis 168 L-RhI具有一定的催化生产D-阿洛糖的能力。如图 8所示，在 60 ℃反应24 h后，有明显的产物峰D-allose生成，此时并无其他明显的产物峰，D-psicose的转化率为34.64%。反应48 h后达到了平衡，此时底物转化率为37.51% (图9)。

图8 以D-阿洛酮糖反应24 h后反应液的液相图Fig. 8 HPLC of the reactants after 24hs’ reaction using D-psicose as the substrate.

图9 催化 D-阿洛酮糖生成 D-阿洛糖的反应过程曲线Fig. 9 Bioconversion of D-psicose into D-allose using the purified L-RhI.

3 结论

本研究将来源于 C. cellulolyticum H10的DPE基因克隆到了宿主菌B. subtilis中，没有添加任何的外源诱导物，即实现了重组 DPE蛋白的高效表达。表达后的重组 DPE蛋白经过镍亲和层析和阴离子交换色谱等方法纯化，纯度达到了电泳纯。纯化后的DPE能高效地催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖，反应1 h即可达到转化率27.34%的反应平衡。

研究还克隆了来源于Bacillus subtilis 168的L-RhI基因，并使其在宿主菌E. coli BL21 (DE3)中得到了表达。纯化后的重组L-RhI达到了电泳纯，并具有催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖的催化活力。

实验证明，利用DPE和L-RhI可以将来源丰富的D-果糖经过D-阿洛酮糖转化生成D-阿洛糖，实现了稀少糖的生物转化。

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