双抗体夹心ELISA检测人胎儿血红蛋白体系的建立

李雪丽，文李艳，冯善伟，钟 梅，刘艳君＊，富 宁

（1.南方医科大学基础医学院 免疫教研室，广东 广州 510515；2.广州市人口和计划生育科学研究所，广东 广州 510410；3.南方医科大学 南方医院，广东 广州 510515）

胎儿血红蛋白（Fetal Hemoglobin，Hb F）由2条α链和2条γ链组成，出生时约占血红蛋白总量的70%，然后快速减少，6－12个月后浓度小于2%，到成年时降至血红蛋白总量的1%以下。在许多血液系统疾病尤其是β地中海贫血的筛查中，检测Hb F是一项不可或缺的指标［1］。在某些恶性肿瘤中，Hb F可作为肿瘤标记物预示肿瘤的发生发展［2］。在产科疾病中，检测HbF可以快速判定胎儿向母体出血等疾病［3］。目前检测Hb F多采用蛋白质电泳、抗酸染色和碱变性法，这些方法灵敏度比较低，而灵敏度和准确度较高的高效液相色谱法价格昂贵，不适合大规模筛查［4］。本研究利用自制的抗人Hb F单克隆抗体和兔抗人Hb F多克隆抗体，建立了HbF的单多抗夹心ELISA检测体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 抗人HbF单抗2C8、多抗均由本室自制［5］，HRP－羊抗兔IgG为北京鼎国生物公司产品；BSA购自广州斯佳生物技术公司。自行配制以下试剂：红细胞裂解液（Tris－NH4Cl）包被液系0.05 M 碳酸盐缓冲液（CB，p H9.6）、ELISA 封闭液（5%脱脂奶粉，用洗液配制）、洗液（50m MTris，0.14 M NaCl，0.1%Tween－20，p H8.0）、样品稀释液（50 m M Tris，0.14 M NaCl，1%BSA，0.05%Tween－20，p H8.0）、TMB底物液（临用前 A、B液等体积混匀）、2M H2SO4终止液均自行配制。

1.1.2 主要仪器 多功能酶标仪Perkin Elmer wallac1420；自动洗板机购自美国BIO－RAD公司；37℃数显三用恒温水浴箱，购自金坛市医疗仪器厂。

1.1.3 血液样本 脐带血取自南方医院产前诊断中心，标准品为本实验室工作人员的全血标本；100份血标本取自广州市人口和计划生育科学研究所，以上标本均用高效液相色谱法测定其 含量，于－70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 样品及标准品的制备 用本室工作人员的全血标本作为标准品，对该份标本用高效液相色谱法测定Hb F的含量（百分比），五分类血球仪测定总血红蛋白（Hb），分装并保存于－20℃。取一定体积的标准品或待测血样品，加入9倍体积的Tris－NH4Cl裂解，37℃水浴30 min，加入10×样品稀释液，8 000 rpm离心5 min，取裂解液上清用样品稀释液稀释一定的比例。

1.2.2 检测HbF双抗体夹心ELISA方法的建立用0.05 M CB（p H 9.6）稀释捕获抗体2C8至10 μg／ml，每孔100μl包被，4℃过夜；次日洗液洗涤3遍后，每孔加入5%脱脂奶粉封闭液300μl，37℃2 h；洗涤5遍后，每孔加入100μl标准品及待测样品，于37℃孵育30 min；洗涤5遍后，加入兔抗人Hb F多抗10μg／ml，100μl／孔，37℃30 min；洗涤5遍后每孔加入100μl HRP－羊抗兔IgG（1∶5000），37℃30 min；充分洗涤后加入TMB底物液，常规显色，2MH2SO4终止反应，以波长450 nm测定OD值。以Hb F浓度作为自变量，OD450作为应变量，进行曲线拟合，绘制标准曲线。

1.2.3 100份血标本的检测 用自行建立的Hb F检测体系测定100份全血标本的HbF浓度，每份血标本设立双复孔测定。结果用SPSS13.0进行统计分析。

2 结果

2.1 标准品测定 经测定标准品Hb为137 g／L，Hb F含量为1%。将其裂解后分别稀释为24.66、4.932、0.986、0.197、0.039μg／ml，作为本检测体系标准曲线的五个测定点。

2.2 确定捕获抗体2C8的最佳工作浓度 在检测抗体浓度为5μg／ml时，用不同浓度的2C8抗体包被，进行夹心ELISA检测脐血中Hb F的浓度。结果如图1，当单抗的包被浓度为10μg／ml时，ELISA测定的吸光度值最高，因此，单抗的包被浓度选择为10μg／ml。

2.3 确定检测抗体的最佳工作浓度 在单抗包被浓度为10μg／ml的条件下，用不同浓度的兔抗Hb F多抗检测脐血中Hb F的浓度，比较其检测效果。结果如图2，当多抗浓度为10μg／ml，吸光度值较高且与15μg／ml效果相仿，因此，检测抗体的浓度选择为10μg／ml。

图1 抗HbF单抗2C8不同包被浓度的检测效果比较

图2 兔抗HbF多抗不同浓度检测效果的比较

2.4 标准曲线的建立 标准品裂解后稀释至相应浓度，进行ELISA测定。通过抗原浓度的自然对数Ln（X）与OD450值绘制标准曲线图。结果如图3，标准曲线的回归方程Y＝0.1017Ln（X）＋0.5472，r2＝0.9986.线性范围在0.039－24.66μg／m之间，能够满足临床血标本检测的需要。

图3 HbF浓度的自然对数Ln（X）与OD450值关系图

2.5 可重复性测定

2.5.1 标准曲线的可重复性 分别比较6次实验中标准曲线Y轴90%、50%、10%各点所代表的Hb F浓度，其变异系数见表1。结果可见，3个OD450点所代表的浓度值的变异系数均小于15%，说明标准曲线的可重复性较好。

表1 标准曲线的可重复性测定（n＝6）

2.5.2 批内、批间差异测定 取3份含不同Hb F浓度的全血标本，与标准曲线同时测定，每次实验每种浓度进行6次重复测定（每次测定设立2复孔，取其平均值为一个实验数据，即每种浓度同时做12孔），反复进行6次重复实验，计算批间批内变异系数，结果见表2、3。本体系批内平均变异系数6.6%，批间平均变异系数6.4%，说明本检测体系的可重复性好。

表2 HbF检测实验批内可重复性测定（n＝6）

表3 HbF检测实验批间可重复性测定（n＝6）

2.6 100份血标本的HbF含量检测结果 100份血标本的ELISA结果与高效液相色谱法结果比较如表4，以HbF占总血红蛋白的1%作为临界值，ELISA结果与高效液相色谱法符合率为89%，经χ2检验，两种检验方法之间无统计学差异（χ2＝0.216，P＞0.05）。

表4 100份血标本测定的卡方检验表格

3 讨论

本研究利用自行制备的抗人HbF单抗和多抗成功地建立了人Hb F检测体系。在前期单抗的制备和鉴定中，我们用ELISA、Western blot证明了包被抗体2C8只与Hb F发生特异性结合，与其他两种血红蛋白（Hb A、Hb A2）无交叉反应［5］，本体系采用单抗作为捕获抗体，保证了检测的特异性。在包被单抗已特异地捕获抗原的基础上，多抗与抗原结合的位点和机会都大于单抗，因此，以多抗作为检测抗体，又能保证检测的灵敏度［6］。由于血标本中Hb F的含量并不会很低，因此本体系更偏重于考虑标准曲线的线性关系和检测的特异性，同时，略低的灵敏度也可避免样品稀释倍数过高而造成的误差和不便。本研究结果显示，Hb F的检测灵敏度为0.039μg／ml，标准曲线的拟合系数达到0.9986，线性关系好，批内变异系数小于10%，批间变异系数小于15%，重复性较好。

Hb F的γ链有两种类型：Gγ和Aγ，二者的差别仅为一个氨基酸不同，Gγ136位为甘氨酸，Aγ为丙氨酸。胎儿出生时Hb F含量为总血红蛋白的80%，Gγ占 Hb F的比例为70%，Aγ占30%［7］。至儿童和成人，Gγ占Hb F的比例下降至40－60%。本科室制备的抗Hb F抗体，是用脐血免疫的，前期工作中尝试过以脐血作为标准品，但由于脐血中两种γ链比例与成人不同［8］，脐血与正常人血检测结果存在一定差异。因预期临床样本均来自儿童或成人，为使标准品与检测标本一致，我们选择正常人全血标本作为标准品。在检测Hb F的方法中，高效液相色谱法的准确性最高［4］，因此，标准品的定值采用的是高效液相色谱法。在实验中，我们发现血液标本的冻融次数对于红细胞裂解有一定影响。为保证结果的一致性，标准品和检测标本的冻融次数尽量一致，而在裂解之后加入10×样品缓冲液，既能终止Tris－NH4Cl的裂解，又可使各个浓度梯度的样品处于相同的缓冲条件中。

应用自行建立的ELISA检测了100份血标本，所测值与高效液相色谱法的结果比较，以HbF 1%作为临界值，发现两种方法的符合率约为89%，虽然比较两种方法测定的绝对值，符合率只有40%，但这种差异对于临床以1%为临界值判断Hb F的病理水平并无影响，因此，本ELISA方法可在一定程度上代替高效液相色谱法，更广谱、低廉地应用于临床和基础研究。

Hb F在许多血液系统疾病中都表现为升高，包括地中海贫血、镰刀型细胞贫血、遗传性Hb F持续增多症、骨髓异常增生等疾病［9］。而早在上世纪七十年代人们就开始注意到恶性肿瘤Hb F表达量的增加，现已证明许多恶性肿瘤尤其是胚胎恶性肿瘤，血液系统肿瘤和大肠癌，其 表达量呈明显增加［10］。因此，Hb F的定量检测对于这些疾病的诊断和预防发挥着越来越大的作用。目前，国外商品化试剂盒多采用双多抗夹心ELISA，特异性稍差，且为进口试剂盒，价格昂贵［4］。本实验所建立的单多抗ELISA检测体系特异性强，重复性好，有望应用于以后的临床检测和基础研究。

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