人生长激素对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

乳腺癌是严重危害妇女健康的常见的恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤的首位。近年来，乳腺癌发病率呈上升趋势［1］。国内外研究表明，重组人生长激素（recombinant human growth hormone，rh GH）能显著改善晚期恶性肿瘤患者的营养状况，使其代谢调理和免疫调节作用加强［2］，提高患者治疗效果及耐受性［3］。但rh GH作为恶性肿瘤患者的免疫、营养辅助治疗剂应用于临床，至今仍存在争议［4］，以至于医生及患者对rh GH安全性存在顾虑［5］。本研究旨在探讨人生长激素对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，希望能为临床治疗乳腺癌提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

4－6周龄健康雌性BALB／c裸鼠40只，体质量14－25 g，购自中国科学院上海实验动物中心；人乳腺癌细胞株MCF－7购自中国科学院细胞生物库；rh GH购自上海联合赛尔生物工程有限公司，批号：20070621）；5－氟尿嘧啶（5－FU，0.025 g／m L，天津金耀氨基酸有限公司生产）；流式细胞仪（上海净化设备公司）；原位末端转移酶标记技术（TUNEL）试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立、分组及给药方法 以含10%小牛血清的MEM培养基培养，根据细胞生长情况进行传代。待至细胞数量足够时，将1×107株人乳腺癌细胞 MCF－7悬浮于1 m L的细胞悬液，以0.1 m L／只接种于裸鼠的右臀部皮下。待瘤体长至长径1.0 cm左右，处死裸鼠，取出移植瘤，把2 mm×2 mm×2 mm的瘤体包块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，于无特定病原体（SPF级）条件下饲养，接种后10 d，选取瘤体生长良好的裸鼠采用简单随机分组方法随机分成4组：对照组、rh GH 组、5－FU组和rh GH＋5－FU组，每组10只裸鼠。分组后当日给药，对照组皮下注射与rh GH组等体积的生理盐水0.2 m L，5－FU 组按2 mg／kg 5－FU 溶液给予皮下注射，rh－GH组按2.5 IU／kg rh GH溶液给予皮下注射，rh－GH＋5－FU组同5－FU组和rh GH组，每天1次，连续给药2周。

1.2.2 指标测定 （1）移植瘤瘤重：将剥出的肿瘤去除血污、脂肪等非瘤组织，称量瘤质量。（2）病理组织学检查：取移植瘤组织约0.3 cm。，用4%甲醛固定、脱水，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察计数5个以上不少于1 000个细胞的高倍视野。免疫组法检测移植瘤核增殖抗原（PCNA），TUNEL法检测凋亡细胞，计算凋亡指数（AI）。PCNA阳性细胞判断：细胞核出现明显的深棕色，凋亡细胞细胞核出现棕黄色。AI计算公式如下：AI＝（阳性细胞数／总细胞数）×100%。（3）流式细胞术：分组培养同上，rh GH培养24 h后消化、离心，PBS洗涤2次，70%乙醇固定并4℃过夜。测定前先用PBS洗涤，重悬于缓冲液中，各组细胞浓度约1.5×105／m L。加入1 g／L RNA酶100μL，室温放置1 h，再加入50 mg／L碘化丙啶100μL，避光放置1 h，立即行流式细胞仪定量检测G0／G1期、S期和G2M期人乳腺癌细胞数目，计算细胞凋亡率。细胞增殖指数（proliferation index，PI）按公式计算；PI＝（S＋G2M）／（G0／G1＋S＋G2M）？100%。MTT法检测细胞存活率，在酶标仪上读取光密度（OD）值，检测波长620 nm。细胞存活率（%）＝实验组OD值／对照组OD值×100%。

1.3 统计学处理

运用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK－q法分析，两变量间相关性采用Pearson相关分析；计数资料采用例数表示，组间比较采用χ2检验，以P＞0.05表示差异无统计学意义。

2 结果

实验2周后，与对照组相比，5－FU组和rhGH＋5－FU组的肿瘤质量、PI及S的指标数值明显小于对照组，AI、G0／G1期的指标数值明显大于对照组（均P＜0.01）；与5－FU 组相比，rh GH＋5－FU 组的PI及G2M期的指标数值明显小于5－FU组，G0／G1期存活率明显优于5－FU组（P＜0.05或P＜0.01），其余各项指标差异无统计学意义。各组人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响情况比较结果见表1，图1－3。

表1 各组人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响情况比较（n＝10，±s）组别 肿瘤质量（g） PI（%） AI（%） G0／G1期（%） S期（%） G2 M期（%）对照组（1） 0.421±0.102 52.35±0.94 5.04±0.87 47.32±3.17 38.34±1.87 13.64±0.53 rhGH组（2） 0.383±0.029 53.50±0.62 5.21±1.06 46.25±5.30 39.14±1.99 14.07±1.61 5－FU组（3） 0.172±0.017＊＊ 42.07±0.54＊＊ 7.43±1.38＊ 60.48±6.01＊＊ 26.15±1.83＊＊ 17.82±2.59＊rhGH＋5－FU组（4） 0.114±0.024＊＊ 29.21±0.61＊＊ 7.95±1.29＊ 73.13±4.98＊＊ 21.11±1.05＊＊ 9.25±2.05＊F 15.418＊＊ 15.088＊＊ 7.952＊ 15.296＊＊ 15.165＊＊ 8.872＊q（1）：（2） 1.702 1.035 1.039 1.031 1.024 1.004（10）：（3） 4.825＊＊ 4.790＊＊ 3.532＊ 4.502＊＊ 5.150＊＊ 1.017（1）：（4） 5.012＊＊ 5.123＊＊ 3.785＊ 5.402＊＊ 5.302＊＊ 2.098（2）：（3） 4.907＊＊ 5.004＊＊ 3.603＊ 4.760＊＊ 4.954＊＊ 1.035（2）：（4） 5.013＊＊ 4.828＊＊ 3.748＊ 5.108＊＊ 5.609＊＊ 3.104＊（3）：（4） 2.406 3.819＊ 1.801 3.631＊ 1.014 3.309＊＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

图1 给药结束后流式细胞仪检测乳腺癌移植瘤细胞周期扫描图

由图1可看出给药结束后各组G0－G1期和G2M期细胞百分数比较均无差异。S期：5－FU组和5－FU＋rh GH组比对照组或rh GH组明显降低；而rhGH组与对照组比较无差异。

在给药后，对照组和rh GH组的PCNA呈阴性，而5－FU组和rhGH＋5－FU组的PCNA呈阳性，且rh GH＋5－FU组的颜色较5－FU组浅，见图2。对照组和rhGH组的乳腺癌移植瘤细胞凋亡呈阴性，而5－FU组和rh GH＋5－FU组的乳腺癌移植瘤细胞凋亡呈阳性，且rhGH＋5－FU组的乳腺癌移植瘤细胞凋亡程度明显高于5－FU组，见图3。

图2 给药结束后检测乳腺癌移植瘤PCNA（免疫组化×400）

图3 给药结束后乳腺癌移植瘤细胞凋亡（TUNEL法×40）

3 讨论

乳腺癌的发生发展是一个多步骤、多因素的复杂过程，是妇女常见的恶性肿瘤之一。一般恶性肿瘤患者处于高分解状态，易产生严重的并发症，使患者机体免疫功能低下，影响治疗效果及康复。以往研究表明，单纯给予静脉高价营养（TPN）注射不能显著改善患者高分解代谢和免疫功能低下状态［6］，而生长激素可加强肿瘤患者的代谢调理，改善患者细胞和体液性的全身防御能力［7］，促进创伤患者的正氮平衡、加速伤口愈合、减少并发症，增加了患者对治疗的耐受性并提高其疗效［8］。

5－FU是一种天然存在的尿嘧啶的类似物，是临床常用化疗药物。本研究选择5－FU为实验的阳性对照药，是因5－FU作用于细胞周期的S期，与有关代谢物质发生特异性的拮抗作用，对人乳腺癌细胞及消化道癌症有较强的杀伤效果［9］，本研究证实了这一观点。本研究结果显示，对照组与rhGH组间的各项指标无显著性差异（均P＞0.05），表明人生长激素在体内对人乳腺癌细胞既无明显的增殖作用，也无明显的凋亡作用；rh GH＋5－FU组的肿瘤质量、PI及G2M期的指标数值明显小于5－FU组，G0／G1期的指标数值明显大于5－FU组（均P＜0.05），揭示rhGH不影响5－FU对人乳腺癌细胞生长的抑制作用，即不影响化疗药物的抗癌作用，且产生协同作用，与文献报道相符［10］。产生协同作用的机制为rh GH可下调乳腺癌细胞株MCF－7的Cyclin D基因表达，加强了5－FU对细胞周期G0－G1期的阻滞作用，大大减弱了S期DNA合成和细胞增殖的作用，这种作用一直延续到G2－M期，致使细胞分裂的作用也大大减弱，这就是rhGH与5－FU联合比单用5－FU更好的原因。此外，有文献报道指出rh GH可以有效提高射线对乳腺癌细胞的放射敏感性［11］。本研究结果为rh GH可安全应用于人乳腺癌患者的治疗提供了实验依据，同时也为rh－GH联合化疗药物应用于临床恶性肿瘤患者的治疗提供了理论依据。

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