宜宾芽菜发酵菌种的优选

（四川理工学院生物工程学院，四川自贡 643000）

宜宾芽菜是四川著名的“四大酱腌菜”之一，以小叶芥菜〔Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.var.foliosaBailey〕的叶柄剖丝，晾至余叶渐枯，再配以佐料腌制而成。宜宾芽菜在长期的发展过程中，在产地自然环境和人文因素的共同影响下，逐渐形成了香、甜、脆、嫩、鲜的独特风味，成为家喻户晓的传统酱腌菜。

宜宾芽菜（以下简称芽菜）目前采用传统的自然发酵法生产，即将芽菜存放在发酵池或者陶瓷坛中自然发酵，发酵周期一般为4～6 个月。目前，芽菜的发酵生产周期长且质量不稳定，成为大规模产业化生产的瓶颈。为此，通过菌种选育，从芽菜中筛选出优势菌株，接种于芽菜进行发酵，在保证芽菜质量的同时缩短发酵时间成为目前芽菜研究面临的主要问题。在芽菜发酵过程中，由于微生物新陈代谢作用，形成了芽菜的独特风味，其主要成分为芽菜发酵过程中产生大量的有机酸，这些有机酸与其他物质相互作用，形成了芽菜怡人的风味。因此，研究芽菜品质，可通过有机酸的变化，间接反映出芽菜发酵效果的好坏。目前，有机酸的分析方法主要有酸碱滴定法（刘珍，2004）、薄层色谱法（石尚友 等，2005；冯雅斌 等，2011）、气相色谱法（朱晓兰 等，2004；于世林，2010）及高效液相色谱法（丁明玉 等，1997；邓丛蕊，1997；金高娃 等，2006；庞新安和万英，2007；李银科 等，2011）等。酸碱滴定法只能测定总酸量，不能具体反映出有机酸的种类及其含量，而且操作繁琐；薄层色谱法虽可测定多种有机酸，但测量精度差，不适合定量分析；气相色谱法需衍生步骤，误差较大；而高效液相色谱法操作简便、准确度高、重现性好，可同时定量多种有机酸，因此获得广泛的应用（贾洪锋 等，2008；Zhang et al.，2008；周晓明 等，2011）。芽菜有机酸含量是影响芽菜品质的一种滋味物质，也是区别人工接种和自然发酵的标准之一（朱薇 等，2006；周相玲 等，2011）。

本试验通过对人工接种发酵和自然发酵芽菜产品的有机酸种类及含量进行对比分析，结合芽菜感官评定和理化指标测定结果，对芽菜发酵菌种进行优选，对保证芽菜品质、缩短芽菜发酵周期具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

样品1：自然发酵的芽菜产品；样品2：接种AN∶AE 复合菌种发酵的芽菜产品；样品3：接种AN1∶AE 复合菌种发酵的芽菜产品。以上菌种均由四川理工学院微生物实验室从宜宾双谊富康芽菜中筛选得到，AN 为枯草芽孢杆菌亚种，AE 为橙黄红酵母菌B，AN1为枯草芽孢杆菌亚种诱变菌株。样品2 和样品3 的接种比例相同，3 个样品均在相同的条件下发酵，均在发酵第2个月时从芽菜坛的中部取样。

1.2 仪器与试剂

试验仪器：Agilent1200 高效液相色谱仪，配 Empower 色谱工作站（美国安捷伦公司）；RE-52CS-1 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FA1104 电子天平〔梅特勒-托多仪器（上海）有限公司〕；赛默飞世尔移液器〔赛默飞世尔（上海）仪器有限公司〕；TDL-5C 型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

试验试剂：酒石酸、D-苹果酸、L-苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、草酸，分析纯（成都市科龙化工试剂厂）；乙酸，分析纯（成都金山化学试剂有限公司）；磷酸氢二铵，色谱纯（成都市科龙化工试剂厂）；甲醇、磷酸，色谱纯（美国天地有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 芽菜的感官评定和理化指标测定 将活化的菌种AN、AN1分别和AE 按5%体积比接种到芽菜中，其他工艺同自然发酵法，发酵2 个月后对其进行感官评定（吴谋成，2002）和理化指标测定，3 次重复，取平均值。

感官评定小组由10 人组成。为了减少从测定到形成概念之间的许多因素（如嗜好和偏爱）对检验结果的影响，采用双盲法进行检验，对样品进行密码编号（采用3 位随机数字），检验样品随机化。评定时由感官评定成员单独进行，相互不接触交流，每个样品评定前用清水漱口（吴谋成，2002）。

芽菜中的水分、还原糖、NaCl、氨基态氮含量及pH 值测定参照SB/T 10213；亚硝酸盐含量测定参照GB 5009.33。

1.3.2 芽菜的有机酸测定

1.3.2.1 样品前处理 准确称取芽菜样品1、样品2、样品3 各20 g，剪碎，加入超纯水50 mL，75 ℃水浴中分别提取30 min，冷却后补足水分，过滤后取滤液，离心（8 000 r·min-1）20 min，取上清液5.0 mL，待用。

1.3.2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；检测器：VWD，检测波长为210 nm，色谱柱流速0.8 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流动相：磷酸盐缓冲溶液（pH=2.3）∶甲醇（95V∶5V）。

1.3.2.3 定量定性分析 标准溶液的配制：分别将草酸、酒石酸、D-苹果酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸配制成有机酸标样系列溶液及有机酸混合标准品溶液，有机酸混合标准品溶液中草酸浓度为20 μg·mL-1，其余有机酸浓度均为100 μg·mL-1。按照确定的色谱优化条件分别进样分析，绘制标准曲线，得出线性方程。

有机酸定性定量分析方法：有机酸的定性方法是在1.3.2.2 的色谱条件下进样各有机酸的单标溶液，确定各有机酸的保留时间，然后再进样有机酸混合标准品溶液，得到有机酸混合标准溶液的色谱图，根据单标有机酸的保留时间来区别混合标准品溶液中有机酸的种类，最后结合添加标样量的方法来确定。样品中有机酸的定性方法与有机酸混合标准品溶液的定性方法类似。

有机酸的定量方法采用标准溶液的峰面积外标法来测量，通过制作8 种有机酸的标准曲线，对样品中有机酸进行定量分析。

回收率：采用加样回收率测定法，取已处理好的的样品3 样液10 mL 于100 mL 容量瓶中，分别加入定量乳酸、草酸、乙酸及琥珀酸等8 种有机酸标准液，定容。按1.3.2.2 色谱条件分别测定其含量，3 次重复，计算其回收率。

2 结果与分析

2.1 芽菜的感官评定和理化指标测定结果

感官评定是检测芽菜质量的一个重要指标。以样品1 为标准，对其他样品进行评分。其中，色泽、香味、甜味、嫩、柔软5 方面若优于样品1，则根据不同感官加分，反之则减分；若刺激味、酸味、咸味、苦味、涩味比样品1 强则相应减分，反之加分。由表1 可知，样品1 总分为0，样品2 总分为3 分，样品3 总分为8 分，即样品3 的感官效果最佳。

表1 宜宾芽菜的感官评定结果

测定理化指标是检验芽菜质量的另一个重要检测手段（陈斌和黄星奕，2004）。本试验在国家腌菜质量标准的基础上，对涉及到芽菜的质量、品质及风味的各项理化指标进行了测定。结果表明（表2），人工接种发酵的芽菜样品（样品2、样品3）和自然发酵的芽菜样品（样品1）的理化指标基本吻合。

表2 宜宾芽菜的理化指标测定结果

2.2 芽菜的有机酸测定结果

2.2.1 回归方程和图谱 标准品稀释适当倍数，用0.45 μm 的微孔滤膜过滤后进样10 μL，按优化后的色谱条件对混合有机酸标准溶液进样分析，在15 min 内实现了8 种有机酸基线的分离，得到了有机酸标准品色谱图（图1）。以质量浓度x（mg·mL-1）对峰面积y（mAU）求得不同浓度的乙酸、草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、L-苹果酸和D-苹果酸的面积标准曲线及线性相关系数（表3）。

图1 有机酸标准HPLC 图

由图1 和表3 可知，苹果酸会出现2 次保留时间，是因为苹果酸分为D-苹果酸（5.827 min）和L-苹果酸（10.280 min），它们出现的峰保留时间不同。

2.2.2 回收率 从表4 可以看出，各种有机酸的平均回收率在93.10%～98.46%之间，说明该试验方法测定的结果可靠。

2.2.3 样品有机酸的测定结果 将样品按有机酸定性定量分析的方法进行处理，在已确定色谱条件下进样分析。在相同条件下每个样品平行进样2 次，每次进样10 μL，记录结果，其色谱图分别如图2、3、4所示。

表3 各种有机酸的线性回归方程及相关系数

表4 各种有机酸的回收率

通过比较图2、3、4 可以看出，人工接种的样品2 和样品3 峰的数量、峰面积大小都明显多于未接种的样品1，其中样品3 比样品2 的峰面积大，这可能是由于人工接种打乱了芽菜自然发酵的微生物体系，使乳酸菌和酵母菌在短时间内得到大量繁殖，产生大量的代谢产物，使芽菜的发酵周期变短，风味物质增多；而样品1（自然发酵）的一般发酵周期长达4～6 个月，在短期内（2 个月）还没有发酵成熟，所以有机酸峰的数量、峰面积都明显少于人工接种的芽菜样品。样品2 和样品3 相比较，样品3 的有机酸的种类及含量较多，表明诱变的菌种在芽菜发酵中效果比未诱变的菌种好。

将各样品色谱图与有机酸标准色谱图进行对比，用外标法确定不同样品芽菜中有机酸的含量，结果见表5。

由表5 可知，样品1 中的有机酸主要为草酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、L-苹果酸；样品2 和样品3 中的有机酸主要为草酸、酒石酸、D-苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸。3 个样品中的有机酸种类及含量有明显差异，造成这种差异的原因可能是由于人工接种改变芽菜发酵的微生物区系而使代谢产物发生改变。样品3 的有机酸含量最高，其中乳酸（18.930 mg·g-1）和乙酸（1.704 0 mg·g-1）的含量比样品1 和样品2 高很多，表明通过诱变的菌种产酸能力增强，诱变达到了理想效果。

图2 样品1 的有机酸HPLC图

图3 样品2 的有机酸HPLC图

图4 样品3 的有机酸HPLC图

表5 样品中有机酸的种类及含量 mg·g-1

3 结论

反相高效液相色谱法能够快速、准确地分析不同样品芽菜风味物质的差异。在相同的环境条件下，人工接种发酵的芽菜样品的风味物质种类及含量明显高于自然发酵的芽菜样品。

通过检测不同菌种发酵样品中的有机酸种类及含量，结合感官评定和理化指标测定结果表明，AN1∶AE 复合菌种为最优菌种，其发酵产品（样品3）总酸含量最高，达到35.97 mg·g-1。

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