中国马铃薯主要育成品种抗病毒分子标记分析

赵兴涛 徐建飞 庞万福 卞春松 段绍光 刘 杰 段艳凤 金黎平

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

马铃薯（Solanum tuberosumL.）栽培面积广泛，是世界上仅次于水稻和小麦的第三大粮食作物。中国是马铃薯生产第一大国，全国各地均有栽培（金黎平和屈冬玉，2002）。病毒病是为害马铃薯的重要病害，是造成马铃薯种薯退化的重要因素，每年世界上由于马铃薯病毒病造成的减产至少为20%（王晓明 等，2005）。

在引起马铃薯病毒病的病毒中，PVY（potato virus Y）和PVX（potato virus X）是危害较为严重的两种病毒。Ryadg是控制马铃薯对PVY 具有极端抗性（extreme resistance，ER）的基因，来源于安第斯栽培种（Solanum tuberosumssp.Andigena），1996年被定位在第11 号染色体的末端（Hämäläinen et al.，1997），Kasai 等（2000）设计了与该基因紧密连锁的分子标记RYSC3，目前该标记已开始应用于国外的育种进程（Ottoman et al.，2009）。Rx基因控制马铃薯对PVX 的极端抗性，Rx1（Rxadg）来源于安第斯栽培种，Rx2（Rxacl）来源于野生种无茎薯（Solanum acaule），1991年被分别定位在第12 号和5 号染色体（Ritter et al.，1991），这两个基因的克隆分离分别于1999年和2000年完成（Bendahmane et al.，1999，2000），Ohbayashi 等（2010）根据Rx1基因的序列设计了STS 标记Rxsp，研究结果显示该标记与基因的重组率仅为1.3%（Mori et al.，2011）。

本试验利用与抗PVY 和PVX 基因Ryadg和Rx紧密连锁的分子标记RYSC3 及Rxsp，对我国190 份马铃薯主要育成品种进行了检测分析，以期为马铃薯抗病毒育种、优良基因聚合及分子标记辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试马铃薯主要育成品种190 份（表2），由全国18 个省、市22 个单位提供。于2008年种植于河北张家口坝上试验基地，每品种10 株，株距0.3 m，行距0.6 m，常规田间管理。

1.2 DNA提取

取苗期植株幼嫩、健壮新鲜的叶片，采用CTAB 法结合高通量的Retsch 细胞破碎仪（Retsch Inc.，Haan，Germany）快速提取植物基因组DNA（Jones ＆ Walker，1963），1.0%琼脂糖凝胶电泳检测浓度和质量后，样品稀释至10 ng·μL-1，置-20 ℃冰箱保存。

1.3 分子标记分析

标记信息见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 标记信息

RYSC3 标记PCR 扩增体系10 μL，其中10 ng·μL-1模板DNA 2.0 μL，10×TaqBuffer 1.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 0.8 μL，5 μmol·L-1上游引物0.25 μL，5 μmol·L-1下游引物0.25 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.2 μL，ddH2O 5.5 μL；Rxsp 标记PCR 扩增体系10 μL，其中10 ng·μL-1模板 DNA 2.0 μL，10×TaqBuffer 2.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture1.0 μL，5 μmol·L-1上游引物1.0 μL，5 μmol·L-1下游引物1.0 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 2.9 μL。试剂均为天根生化科技（北京）有限公司产品。

36 个循环PCR 反应程序：94 ℃变性30 s，Tm 退火30 s，72 ℃延伸1 min。第1 个循环之前94 ℃预变性10 min。最后72 ℃延伸10 min。扩增反应在Veriti PCR 仪（Applied Biosystems 公司）上进行。PCR 产物于1.2%琼脂糖凝胶、电压8 V·cm-1条件下电泳40 min，溴化乙锭（EB）着色后经直观成像系统Chemi-Smart 3100（Vilber Lourmat 公司）成像（图1）。

图1 RYSC3 与Rxsp 标记在部分马铃薯品种中的扩增结果

2 结果与分析

2.1 我国马铃薯主要育成品种抗病毒标记分析

对190 份供试马铃薯品种进行RYSC3 和Rxsp 标记分析，160 份品种既不含RYSC3 标记，也不含Rxsp 标记，占到了供试品种的84.2%；只含有RYSC3 标记的品种15 份，占供试品种的7.9%；只含有Rxsp 标记的品种8 份，占供试品种的4.2%；既含RYSC3 标记也含Rxsp 标记的品种7 份，占供试品种的3.7%（表2）。

表2 我国马铃薯主要育成品种RYSC3 和Rxsp 标记分析结果

2.2 我国马铃薯抗病毒品种育成亲本来源分析

在含有 RYSC3 标记的品种中，国际马铃薯中心（CIP）引进的资源材料所育成的品种占31.8%，新型栽培种所育成的品种占9.1%（表3）；在含有Rxsp 标记的品种中，国际马铃薯中心引进的资源材料所育成的品种占26.7%，新型栽培种所育成的品种占20.0%。

表3 我国马铃薯抗病毒品种育成亲本来源分析结果

2.3 我国马铃薯抗病毒品种育成年份分析

在含有RYSC3 标记的马铃薯品种中，2001年之前审定的品种9 份，2001年之后审定的品种11 份，分别占供试品种的40.9%与50.0%（表4）。在含有Rxsp 标记的品种中，2001年之前审定的品种3 份，2001年之后审定的品种12 份，分别占供试品种的20.0%与80.0%。

表4 我国马铃薯抗病毒品种育成年份分析结果

3 结论与讨论

20 世纪30年代至今，国际上将马铃薯野生种作为优良抗性基因的来源广泛应用于抗性育种进程。而在我国，特别是20 世纪90年代以前，育种亲本单一，遗传多样性差的问题比较突出。2000年以来，我国马铃薯育种发展迅速，育成的品种数量迅速增加，遗传基础狭窄的情况有所改善，但是审定品种亲缘关系近，遗传多样性仍较差（徐敏 等，2007），许多控制优良性状的基因不能引入到育种中。

本试验利用与Ryadg和Rx基因连锁的两个标记RYSC3 和Rxsp，对190 份我国主要育成的马铃薯品种进行了检测分析，揭示了两个抗病毒基因在我国马铃薯品种中的分布情况。虽然所用标记较少，不足以完全代表我国马铃薯品种的抗病毒基因携带情况，但结果可以反映出以下问题和情况：①我国审定品种中含有优良抗病毒基因的比例较小；②在含有抗病毒标记的品种中，由新型栽培种资源或从CIP 引进的资源育成的品种占了40%以上，这表明利用这两种类型的材料，有助于提高材料抗病毒基因的多态性；③2001年以来，育成的含有抗病毒标记的品种数量明显增加，说明我国马铃薯抗病毒育种取得了长足的进步。

目前，分子标记技术已经广泛应用于马铃薯遗传图谱的构建、重要性状的基因定位克隆以及马铃薯种质资源的研究。这些为马铃薯的分子标记辅助育种打下了良好的基础，也为提高我国马铃薯综合育种水平和加快育种进程提供了良好的机遇。然而，由于缺乏足够多的与目标基因紧密连锁的标记使得实际用于育种实践的标记较少（Carrasco et al.，2009），因此开发更多的与重要性状紧密连锁的分子标记并应用于标记辅助选择进程，是一项紧迫和重要的工作。

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