辣椒不同外植体处理方法对组织培养再生的影响

曹亚从 张正海 王立浩 毛胜利 张宝玺

（农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，中国农业科学蔬菜花卉研究所，北京 100081）

辣椒（Capsicum annuumL．）属于茄科（Solanaceae），是一种重要的蔬菜作物，与番茄、马铃薯等其他茄科蔬菜作物相比，其组织培养的再生率很低（Liu et al.，1990），属于顽拗型再生植物。辣椒不同基因型的外植体，其内源激素水平有很大差异，而且不同组织器官内源激素分布有差异（李浚明，2002），所以不同基因型、不同组织器官很难建立一个通用的组织培养再生体系。辣椒再生困难主要表现为芽诱导率以及伸长率低。在辣椒芽诱导培养中，通常在培养基中添加植物生长物质，以提高芽诱导率，使用较多的是IAA 和6-BA 组合（Agrawal et al.，1989；Sanatombi ＆ Sharma，2008），以及TDZ（Manoharan et al.，1998；Dabauza ＆ Pena，2001；Ahmad et al.，2006）、ZT（Binzel et al.，1996）等，也有报道称通过调整培养基中的有机成分可以促进芽的分化（Hyde ＆ Phillips，1996；Husain et al.，1999；罗齐军，2005），无机物AgNO3也常被用来促进芽的分化（Hyde ＆ Phillips，1996）。细胞分裂素能促进细胞的分裂，对于伸长有一定的抑制作用，在辣椒再生培养的伸长培养基中通常降低细胞分裂素的含量，并加入GA3来促进再生芽的伸长（Berljak，1999；Steinitz et al.，1999；Arouset al.，2001；Joshi ＆ Kothari，2007）。

外植体的类型对于辣椒的组织培养再生有很大影响，Valadez-Bustos 等（2009）的研究表明，以子叶为外植体时，再生芽难以形成正常植株，多为丛生的畸形芽或叶状体，而以下胚轴为外植体诱导出的芽容易生成再生植株。张宗江等（1994）研究认为由子叶诱导出的叶状体实际上是外植体组织的延伸，所以并不能形成正常的芽。笔者曾以本试验中的5 个品系为试材，以子叶作为外植体进行辣椒的组培再生，发现了相似的现象，只得到了较少的再生植株（待发表）。

组织培养再生是遗传转化的必要前提，本试验以5 个基因型的辣椒为试材，采用不同处理方法的外植体，在添加或不添加植物生长物质的MS 培养基上进行再生培养，以期建立良好的再生体系，旨在为辣椒的遗传转化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料 3 个甜椒自交系（0510、0516、77013）和2 个辣椒自交系（0818、0819）均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒课题组选育。

1.1.2 培养基成分 M0，MS+蔗糖30.0 g·L-1+琼脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M1，MS + IAA（0.2、0.4 mg·L-1）+ 6-BA（4.0、5.0、6.0 mg·L-1）+ 蔗糖30.0 g·L-1+ 琼脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M2，MS + IAA（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1）+ 6-BA（4.0、5.0、6.0 mg·L-1）+ AgNO3（0、5.0、10.0 mg·L-1）+ 蔗糖30.0 g·L-1+ 琼脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M3，MS + ZT 或TZT（2.0 mg·L-1）+蔗糖30.0 g·L-1+ 琼脂8.0 g·L-1（pH 6.0）。

1.2 无菌苗的获得

种子在75%酒精中浸泡处理1 min，再用有效氯9%的次氯酸钠溶液浸泡10 min，然后用无菌水以流水的方式冲洗20 s，获得无菌种子。将无菌种子播于M0和M1培养基，置于27 ℃、每天光照16 h 的培养箱中培养，获得无菌苗。

1.3 不同处理方法外植体的再生

1.3.1 下胚轴切段的再生 采用M0培养基上生长的无菌苗，当无菌苗的下胚轴刚伸直时（播种后10～12 d），切去子叶、生长点和根，将下胚轴截为1 cm 左右的小段作为外植体，置于M0和M2培养基（Agrawal et al.，1989；Arroyo ＆ Revilla，1991；Christopher ＆ Rajam，1996；Sanatombi ＆ Sharma，2008），20 d 更换一次培养基。

1.3.2 直接斩首后下胚轴的再生 采用M0和M1培养基上生长的无菌苗，分3 个时段进行处理，分别是：无菌苗还未脱掉种皮时（播种后约7 d），紧挨萌发孔处切去子叶及生长点；无菌苗长至弯钩状时（播种后约9 d），从弯钩处剪去子叶及生长点；无菌苗的下胚轴刚伸直时（播种后10～12 d），从子叶下方约5 mm 处剪去子叶和生长点。去除子叶和生长点的带根下胚轴继续置于原培养基中培养，20 d 更换一次培养基。

1.3.3 针刺斩首后下胚轴的再生 采用M0培养基上生长的无菌苗，分2 个时段进行处理，分别是：当无菌苗长至弯钩状时，用无菌针刺破下胚轴弯钩处，继续在原培养基上培养12 d 后，从子叶以下1～2 mm 处剪去子叶及生长点（Ramirez-Malagón ＆ Ochoa-Alejo，1996）；当无菌苗的下胚轴刚伸直时，从子叶下方约5 mm 处刺破下胚轴，继续在原培养基上培养12 d 后，从子叶以下1～2 mm 处剪去子叶及生长点。20 d 更换一次培养基。

1.3.4 半粒种子的再生 处理方法参照Ezura等（1993）的方法，将无菌滤纸放于已灭菌的培养皿中，用无菌水将滤纸浸润后，将无菌种子置于滤纸上预培养3 d，培养条件同无菌苗的培养。预培养3 d 的无菌种子从萌发孔处横切为两部分（图1），将带有子叶、胚芽和部分下胚轴的半粒种子（图1 中B 部分）置于M0培养基，将带有部分下胚轴及胚根的半粒种子（图1 中A 部分）置于M0和M3培养基（Binzel et al.1996），20 d 更换一次培养基。

图1 种子切割示意图（用于半粒种子培养）

1.4 数据统计与分析

外植体培养90 d 后，对外植体数、出芽外植体数进行统计。

2 结果与分析

2.1 不同处理方法外植体对辣椒组织培养再生的影响

不同处理方法外植体对辣椒的组织培养再生有明显的影响，表2 中比较了几种处理方法外植体再生率的差异。在添加植物生长物质的培养基中外植体未诱导形成再生芽（表1），此处仅讨论未添加植物生长物质培养基中外植体的再生情况。

表1 不同处理方法、不同基因型的外植体再生状况

5 份材料的下胚轴切段均能形成愈伤组织（图2-a），但均未诱导出再生芽。

当无菌苗还未露出子叶、长至弯钩状或下胚轴刚伸直时切去子叶及生长点，在伤口处会形成大量愈伤组织。90 d 后统计再生状况，只有0516 还未露出子叶时直接斩首后的带根下胚轴（图2-b），以及0819 长至弯钩状态时直接斩首后的带根下胚轴（图2-c）各长出一个伸长的再生芽。

针刺下胚轴的伤口处会形成白色愈伤组织，剪去子叶及生长点7～10 d 后，部分针刺伤口处会分化出叶片，约30 d 后有明显伸长的再生芽形成（图2-d），斩首的伤口处不分化形成叶片及再生芽。90 d 后统计再生状况，0510 下胚轴刚伸直时针刺后斩首的带根下胚轴，以及0516下胚轴弯钩状时针刺后斩首的带根下胚轴未形成再生植株。

带有子叶、胚芽以及部分下胚轴的半粒种子会在伤口处形成根（图2-e）；带有胚根及部分下胚轴的半粒种子播于MS 固体培养基上后，长出正常的根，有的外植体伤口处只形成大量白色愈伤组织（图2-f），有的外植体伤口处形成少量白色愈伤组织，也有外植体在伤口处形成绿色不定芽，并形成叶片（图2-g），大约播种30 d 后，部分外植体有再生芽出现（图2-h）。外植体形成明显再生芽的诱导时间存在差异，播种后30～90 d 期间均有伸长的再生芽形成。大部分外植体只形成一个伸长的再生芽，只有极少数形成两个以上伸长的再生芽（图2-i）。

不同处理方法的外植体，形成再生芽的时间也存在差异。当以带有胚根和部分下胚轴的半粒种子作为外植体时，从播种开始大约30 d 有再生芽形成；直接斩首后的外植体，从播种开始约40 d 有再生芽形成；针刺后斩首的外植体，从播种开始大约45 d 有再生芽形成。

以带有胚根和部分下胚轴的半粒种子作为外植体时，再生率最高，而且再生速度快，再生芽能正常伸长，在本试验中此种处理方法的外植体最有利于辣椒的组培再生。

图2 不同处理方法外植体对辣椒组织培养再生的影响

2.2 植物生长物质对辣椒幼苗及外植体组织培养再生的影响

在不添加植物生长物质的培养基中，辣椒幼苗及外植体的根部生长状态正常（图3-a），在添加植物生长物质的培养基中生长的幼苗及外植体根部变粗，生长状态异常（图3-b）。

图3 植物生长物质对辣椒根部生长的影响

在添加植物生长物质的培养基中生长的下胚轴切段、直接斩首后带有根的下胚轴和半粒种子均未诱导出再生芽（表1）。

2.3 基因型对辣椒组织培养再生的影响

本试验中，不同基因型的辣椒再生率存在差异（表2）。在不添加植物生长物质的培养基中，2 个辣椒品系的平均再生率（9.00%）明显高于3 个甜椒品系的平均再生率（0.77%）。

表2 不同处理方法、不同基因型的外植体在未添加植物生长物质的培养基上的再生率 %

辣椒品系、甜椒品系内部再生率也存在差异。甜椒品系0516 的平均再生率（1.07%）明显高于0510（0.42%）和77013（0.82%），辣椒品系0818 的平均再生率（9.85%）明显高于0819（8.16%）。

2.4 AgNO3对外植体的影响

在下胚轴切段进行再生的过程中，添加 AgNO3的培养基中外植体的颜色较深，在不添加AgNO3的培养基中外植体的颜色较浅，而且呈现出玻璃化的状态。添加AgNO3可能对减少外植体的玻璃化状态有一定的作用，但对于外植体的再生并无明显的促进作用。

3 结论与讨论

根部和幼嫩叶片能够合成生长素和细胞分裂素（武维华，2008），Ramirez-Malagón 和Ochoa-Alejo（1996）以及Pozueta-Romero等（2001）认为子叶在生长过程中形成的植物激素对于形成伸长的再生芽有重要作用，切除子叶和生长点后，只带有胚根和下胚轴的外植体并不能形成伸长的再生芽。然而，与其结果不同的是，在本试验中带有胚根和部分下胚轴的外植体能够在不添加植物生长物质的培养基中形成再生芽，此结果说明根在再生芽形成过程中有重要作用，可能是根部合成的生长素和细胞分裂素促进了下胚轴的再生。针刺后斩首的带根下胚轴（下胚轴形成伤口后一段时期内仍保留子叶，并有真叶形成）的再生率高于直接斩首的带根下胚轴（下胚轴形成伤口后不保留子叶），说明叶片对再生芽的形成有促进作用，可能是叶片合成的激素在一定程度上促进了再生芽的分化。

在辣椒的组织培养再生中，常使用生长素（IAA）和细胞分裂素类（6-BA、TDZ、ZT）这两类植物生长物质来促进再生芽的分化（Agrawal et al.，1989；Binzel et al.，1996；Ahmad et al.，2006）。然而，在本试验中不带子叶、胚芽及胚根的下胚轴切段，即使在添加了生长素和细胞分裂素的培养基中，也未分化出再生芽。可能原因是本试验中采用的植物生长物质浓度、配比没有满足所采用外植体再生的需求。

基因型对辣椒的离体再生有很大影响，这也是对辣椒再生研究最多的一个影响因素。对于特定的培养方法，选择合适的基因型是建立高效、稳定再生体系的前提。本试验中采用的2 个辣椒品系（0818、0819）的再生率远远高于3 个甜椒品系（0510、0516、77013），这与前人的报道相吻合（陈静娴和聂凡，1990；Dabauza & Pena，2001；罗齐军和曾富华，2007），辣椒品系比甜椒品系易形成再生植株。

辣椒的组培再生芽可以由外植体伤口处直接诱导形成，也可以由伤口处形成的愈伤组织再分化形成，但是在辣椒的组培再生中，由愈伤组织再分化出芽的比率很低（沈火林 等，1993），再生芽往往是由伤口处直接形成（别之龙和刘佩英，1996）。本试验也发现类似的现象，再生芽往往在伤口边缘的表皮处形成，当伤口处形成大量白色愈伤组织，并将伤口覆盖后，往往不能形成再生芽。将带有胚根和部分下胚轴的半粒种子形成的白色愈伤组织剥除后，可以看到在伤口周围有一些很小的绿色芽点，可能是大量的白色愈伤组织阻碍了这些绿色芽点的继续发育；然而，针刺后斩首的带根下胚轴，在其针刺伤口处，可形成大量白色愈伤组织，再生芽与大量白色愈伤组织同时存在，但是，再生芽往往在伤口边缘形成，并不是由愈伤组织再分化形成，这些现象表明，不经愈伤组织或胚状体结构而形成的再生芽，可能与亚麻下胚轴再生培养中观察结果相似（李浚明，2002），再生芽可能是由下胚轴的表皮细胞形成。

辣椒的组培再生研究中，可以利用的外植体类型很多，Ebida 和Hu（1993）研究发现，子叶、茎尖和下胚轴均能形成再生植株，子叶的再生能力最强。但是由于基因型、培养基等因素的互作，不同研究中会出现相异的结果。本试验中，当以带有胚根和部分下胚轴的半粒种子为外植体，2 个辣椒品系有良好的再生效果，而且再生芽通常能伸长，形成正常再生植株，但在此方法操作过程中要注意剔除假再生植株，再生芽通常由表皮细胞处形成，由下胚轴横切面中心部位形成的芽通常是由原生长点形成，不是再生芽，需要剔除。

组织培养再生过程中，培养基的成分对于诱导形成再生植株有重要影响，在辣椒的组培再生中，通常采用MS 培养基，Szász 等（1995）、Ebida 和Hu（1993）、Arroy 和Revilla（1991）均以MS 培养基为基本培养基，进行辣椒的组织培养再生，诱导出了完整的再生植株，但是在培养基中添加了不同的植物生长物质。而在本试验中，在不添加植物生长物质的MS 培养基中，以带有胚根和部分下胚轴的半粒种子为外植体，获得到了良好的再生效果，避免了因添加植物生长物质而造成植株变异的情况。而且这种方法不需要进行再生根的诱导，在一定程度上提高了再生率。

以带有胚根和部分下胚轴的半粒种子为外植体，再生率较高，无植物生长物质的不良影响，操作比较方便，可以尝试用于辣椒的遗传转化研究。

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