不同栽培制度对黄瓜连作土壤微生物群落结构的影响

王旭晖 张雪艳，2 高丽红*

（1 中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193；2 宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

设施农业已成为农业增效和农民增收最直接和最有效的途径。但生产上盲目性投入和单一重复性种植模式，是生产实践上的主要问题（van Bruggen & Semenov，1999）。随着连作年限的增加，土壤环境不断恶化，进而造成蔬菜病虫害严重、产量降低、品质下降等现象（孙光闻 等，2004），严重制约设施农业的可持续发展。轮作是克服连作障碍的有效技术措施，研究表明轮作可以改善土壤理化性质（姚静 等，2003）和微生态环境以及提高酶活性（于立芝 等，2002；李海燕 等，2006；张雪艳 等，2009），进而提高作物产量。由于微生物广泛参与土壤养分循环、残体分解等过程，被称为土壤环境的内部操纵者（Doran ＆ Zeiss，2000）。一般来说，土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高，抗病的综合能力就越强（焦晓丹和吴凤芝，2004）。黄瓜（Cucumis sativusL.）作为设施重要栽培蔬菜，连作障碍问题不容忽视，运用PCR-DGGE 方法研究表明：轮作对修复黄瓜连作土壤微生物群落结构有一定的影响（于高波等，2011）。

本试验选择连作8 a 的土壤，以黄瓜为主栽作物，在温室夏季休闲种植普通白菜（小白菜）、茼蒿、青蒜等叶菜类蔬菜，同时设计了番茄轮作与青蒜间作等栽培模式，连续进行5 a，评价长期采用不同栽培制度对土壤微生物群落结构多样性的影响，拟从土壤微生态这一角度寻找有利于温室土壤保持健康的栽培模式，为设施土壤可持续利用栽培制度的制定提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2009年1～12月在中国农业大学科学园日光温室内进行，供试土壤为连作8 a、进行试验设计栽培制度5 a，本试验为不同栽培制度第6年的土壤。供试种植盆直径25 cm，盆深28 cm，为防止试验过程中塑料盆受外界环境的影响，将塑料盆埋于地下，盆口稍高于地面。试验设计4 个处理（表1），栽培茬口分为早春茬、夏茬和秋冬茬，以连续两茬种植黄瓜、夏茬休闲处理为对照。每个处理3 次重复，随机区组排列，每个处理为1 个小区，种植15 盆，小区间随机区组排列。供试黄瓜品种为津育5 号，大蒜（Allium sativumL.）品种为成都二水早，番茄（Lycopersicon esculentumMill.）品种为中杂9 号，茼蒿（Chrysanthemumsp.）为台湾虎耳大叶茼蒿，普通白菜〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕为耐热型品种京冠1 号。

夏季休闲期间所有处理均不施肥，仅根据栽培作物对水分的需求进行统一水分管理。秋冬茬和早春茬黄瓜定植前，每盆施入膨化鸡粪肥500 g，将盆中土彻底混匀，为保证试验期间各处理养分投入量相同，在黄瓜生长期间各处理补充相同量的山崎黄瓜营养液（郭世荣，2003）。

表1 试验设计

1.2 样品采集与处理

每一茬口结束时取每盆0～20 cm 的表层土壤，以小区为单位将土样混匀后过2 mm 筛。一部分于4 ℃冰箱保存，用于群落水平碳源利用（Biolog）分析，另一部分于-20 ℃冰箱保存，用于变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤微生物群落功能多样性测定 采用Biolog-ECO 测定方法。根据土壤含水量称取相当于10 g 干土质量的湿润土壤于250 mL 三角瓶中，加90 mL 去离子水，4 ℃下置200 r·min-1震荡1 h，静置3 min 后吸取2 mL 置50 mL 试管中，加18 mL 去离子水，充分混合后吸取2 mL 于另一个试管中，再加18 mL 去离子水，得到土壤稀释液。吸取稀释液150 μL 加至ECO 板微孔中，之后将ECO 板于25 ℃黑暗培养，每24 h 在590 nm 波长下读取光密度值，直至读值稳定，上述操作均在无菌条件下完成（Classen et al.，2003）。根据反应的进程选择第72 小时的数据计算Shannon-weaver 指数、Shannon 均匀度指数，进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

1.3.2 土壤细菌结构多样性的测定

1.3.2.1 土壤微生物DNA 的提取 本试验采用天泽基因工程有限公司DNA 提取试剂盒Soil DNA out 提取土壤微生物DNA。

1.3.2.2 PCR 扩增反应条件 选择5 对引物对细菌16S rDNA 序列V3 区扩增进行比较试验，结果得到F338GC（5′-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggactcctacgggaggcagcag-3′）和R518（5′-attaccgcggctgctgg-3′）扩增结果较好（吴凤芝 等，2008；魏利 等，2008）。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。PCR 为50 μL 体系：10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μL；10 mmol·L-1dNTPmix（每种2.5 mmol·L-1）1 μL；正反向引物（5 pmol·μL-1）各1.5 μL；Taq酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL；DNA 模板（10 ng·μL-1）1 μL；加灭菌双蒸水补足至50 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min 预热；93 ℃解链30 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，10 个循环；93 ℃解链30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，10 个循环；93 ℃解链30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，9 个循环；最后93 ℃解链30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min 结束（王小芬 等，2006）。

1.3.2.3 DGGE 试验条件 本试验采用双梯度法，聚丙烯酰胺凝胶的浓度范围是6%～12%；变性剂浓度范围是30%～60%，在1×TAE 缓冲液（DGGE 专用）中100 V 电压电泳10 h，温度60 ℃。电泳结束后取出凝胶，用10 000 倍的SYBR GreenⅠ染色。在凝胶成像系统上观察试验结果。

1.4 数据分析

Biolog 原始数据采用Excel 2003 整理完成，进一步处理采用SPSS 统计分析软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）、主成分分析。

DGGE 图谱采用凝胺定量软件Quantity One 进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同栽培制度对土壤微生物功能多样性的影响

2.1.1 不同栽培制度下土壤微生物群落功能多样性和均匀度指数 由表2 可以看出，2009年早春茬D1 和D3 处理土壤微生物的Shannon-weaver 指数显著低于其他处理，D2 和D4高于CK，但差异不显著；夏茬各处理间没有显著差异；秋冬茬各处理均显著高于对照。Shannon 均匀度指数具有与Shannon-weaver 指数相同趋势。

2.1.2 主成分分析 如图1所示，早春茬在PC2 上，D4 处理与CK 明显分开，而其他处理之间没有明显分开，说明夏季填闲青蒜处理D4 相对于CK 显著改变了土壤微生物群落组成；夏茬有填闲作物的处理D2、D3、D4 与休闲处理CK、D1 在PC1 和PC2 上都显著分开，表明夏季填闲作物后，土壤微生物碳源利用情况发生改变；秋冬茬CK 处理与其他处理明显分开，说明夏季填闲作物后对土壤微生物群落的影响延续到秋冬茬，并且秋冬茬黄瓜与青蒜间作D1 处理与CK 相比土壤微生物群落组成发生改变。

表2 不同栽培制度下土壤微生物群落功能多样性和均匀度指数

图1 不同栽培制度下土壤微生物群落碳源利用的主成分分析

2.2 不同栽培制度对土壤细菌群落结构的影响

2.2.1 不同栽培制度下土壤细菌群落 DGGE图谱分析 从图2 可以看出，试验中各处理呈现的带型有差别；应用 Quantity one 软件对DGGE 图谱进行初步分析，得到泳道—条带识别图。根据其统计条带（表3）可以看出，秋冬茬黄瓜收获后土壤细菌群落结构在图谱中显示的条带亮度情况都与前两茬不同（图2），说明秋冬茬具有更多的优势种群。夏茬填闲茼蒿D2 处理和填闲普通白菜D3 处理，泳道条带数相同，均为16 条，没有填闲作物的CK 休闲处理为12 条，间作青蒜D1 处理为13 条，说明夏茬填闲速生叶菜可以改善土壤微生物群落结构，增加土壤细菌种类。

2.2.2 聚类分析 在D=0.42 时，所有处理分为两大类（图3），早春茬除去D4 青蒜处理外，其余都聚在一起。在D=0.48 时，夏茬D4 青蒜处理与其他处理分开。在D= 0.52 时，早春茬D4 青蒜处理、秋冬茬D3 普通白菜处理和秋冬茬D4 青蒜处理聚在一起，与其他处理分开。夏茬D2 茼蒿处理和D3 普通白菜处理相似系数最高，达到74%；夏茬和秋冬两茬的CK 休闲处理相似系数达到72%。

图2 16S rDNA V3 片段PCR 产物的DGGE 图谱

表3 16S rDNA V3 片段PCR 产物的DGGE 图谱条带

图3 DGGE 图谱UPGMA 聚类分析

3 结论与讨论

Biolog-ECO 板技术能鉴定土壤中微生物群落功能多样性，但是由于该技术进行的时间较短（一般为7 d 左右），所以只能鉴定出能快速生长的可培养微生物（Li et al.，2006），并且ECO中的31 种碳源不能囊括自然土壤生态系统的所有碳源，因此Biolog-ECO 的试验结果只能评价部分微生物群落功能多样性。PCR-DGGE 利用分子手段显示了土壤中可培养和不可培养的细菌成分。但是当某一种细菌DNA 在总DNA 中的量少于1%时，用PCR-DGGE 方法不能检测（Muyzer＆ Smalla，1998）。虽然Biolog 和PCR-DGGE 存在一定缺陷，较传统方法而言却不失为两种敏锐、快捷的检测方法。

对Biolog 试验得到的数据进行多样性分析，早春茬D1 间作青蒜处理与D3 轮作处理显著低于其他处理，这与本试验第3年和第5年研究结果不同：第3年各处理均高于对照，第5年填闲茼蒿和青蒜处理低于对照，而间作青蒜和轮作处理显著高于对照；夏茬收获填闲作物后，各处理间没有出现显著差异，但填闲作物的处理土壤微生物功能多样性和均匀度高于对照，这与第5年试验结果一致，与第3年试验结果有显著差异；秋冬茬种植黄瓜后，各个处理均高于休闲对照，这与本试验第3年和第5年的研究结果一致（张雪艳 等，2009）。而主成分分析从Biolog试验得到的大量数据中提炼出更具有代表性的指标，更加清晰的描绘了各个栽培制度下土壤微生物碳源利用的情况，与直观多样性分析相互补充来描绘土壤微生物碳源利用情况。本试验为连续性盆栽试验的第6年，试验开始前土壤速效氮含量在30～40 mg·kg-1之间，水平偏低。由于夏茬生长过程中不施用肥料，导致夏茬作物根系生长不旺盛，且夏茬填闲作物本身为浅根系，根系分泌物只作用于表层土壤。取样过程中被非根际土稀释，而作物生长对非根际土中的微生物群落没有明显影响（胡元森 等，2007）。同样由于养分相对不足，本试验早春茬结果与第5年试验结果相比呈现出“大小年”的波动。总体来说，夏季填闲叶菜以及秋冬茬间作青蒜这两种栽培制度在连续6 a 的试验中均对土壤微生物碳源利用起到改善作用，其中填闲青蒜效果最为明显。这与吴凤芝和王学征（2007）研究小麦和大豆与黄瓜轮作能显著提高土壤微生物群落的Shannon-weaver 多样性和均匀度结果一致。

DGGE 图谱检测中的条带数量可以近似表现细菌种群数量，其亮度则表现了该种群数量的多少，亮度越大，数量越多（Hu et al.，2004）。DGGE 图谱中，两年试验均显示出秋冬茬各个处理亮度明显高于其他茬口，优势种群数量增多，这可能和秋季气候变化等因素有关。DGGE图谱中非多态性条带占全部条带的63.38%，这一数据在3 个茬口分别为 77.59%、57.14%和88.24%，说明夏茬填闲不同作物与休闲处理相比，改变了土壤细菌群落多态性。早春茬除去普通白菜处理，这一非多态性指标为93.61%，这说明番茄茬口与黄瓜茬口细菌群落有所不同。

综合来看，夏季填闲茼蒿、普通白菜、青蒜都可以改善土壤微生物群落碳源利用的情况；主成分分析表明，填闲青蒜修复效果最明显；填闲茼蒿和普通白菜对碳源利用影响相似。秋冬茬间作青蒜在本茬口有改善土壤微生物群落功能的作用，但在翌年早春茬由于养分相对不足，可能会出现负面影响。

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